本发明专利技术提供一种适用于牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus-1,OsHV-1)不同变异株检测的巢式PCR方法。该检测方法以牡蛎疱疹病毒DNA聚合酶基因功能结构域核苷酸序列为模板，设计两对嵌套式引物，并以此为主题设计巢式PCR检测方法。由于DNA聚合酶基因在疱疹病毒种内阶元上高度保守，本发明专利技术采用的两对嵌套式引物，可以与目前已知的所有OsHV-1变异株基因组相结合，对这些变异株的特异性DNA核酸片段进行定性检测，灵敏度高，特异性好。利用该检测方法可以克服现有分子检测方法，仅能对OsHV-1部分变异株进行检测的严重缺陷。该检测方法可用于贝类各时期养殖过程中的牡蛎疱疹病毒的跟踪检测，具有很高的使用价值。有望替代牡蛎疱疹病毒之前的相关分子检测方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于贝类病原检测
，具体设及一种通过巢式聚合酶链式反应 (Polymerase Qiain Reaction,PCR)检测牡颇瘤疹病毒（Ostrei化e;rpesvi;rusl ,0sHV-l)的 方法。
技术介绍
自20世纪90年代末W来，OsHV-1引起包括我国在内的全球11个国家和地区海水养 殖双壳贝类的大规模死亡。目前已知受影响的宿主物种包括牡颇(6种），扇贝（2种），始类(2 种）和魅蝴在内的11个物种；其中受影响最严重的是我国养殖的巧孔扇贝 (化lamysfa;rre;ri)和欧洲养殖的长牡颇（Crassos1:reagigas)。建立准确、灵敏和快速的检 测方法是及早发现病害病原并采取相应防控措施前提和基础。 目前对于OsHV-1的检测，最常用的方法是聚合酶链式反应(PCR)技术;PCR所采用 的引物多是基于病毒基因组C区设计的，其中基于C2和C6位点设计的一对引物，被0IE推荐 为该病毒的PCR检测的通用方法，该方法已被多个国家和地区广泛采用。然而最新的比较基 因组学分析结果表明，C区是牡颇瘤疹病毒基因组中序列变异最大的几个基因片段之一。同 时近年来OsHV-1分子流行病学监测数据和研究结果表明，该病毒2008年W来发生了较强的 株系分化；因基因组C区碱基组成或排列顺序发生变异而产生的新变异株不断出现，从而导 致基于该区核巧酸序列设计的OsHV-1检测引物无法与目标位点结合;最终导致基于C区建 立的多种普通和巢式PCR检测方法，不能准确检出部分OsHV-1变异株感染的存在。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种牡颇瘤疹病毒不同变异株的巢式PCR检测方法，可W弥 补现有检测技术只能对部分病毒变异株进行检测的不足，使牡颇瘤疹病毒的检测更准确和 灵敏;可用于双壳贝类各时期养殖过程中牡颇瘤疹病毒的跟踪检测。 本专利技术首先提供一种检测牡颇瘤疹病毒的巢式PCR检测引物， Pol-F:5f-GATTTCAACTCGCAATACC-3>(沈Q ID N0:1)、 P〇l-R:5f-GGCAGACACAGATTCCACA-3>(沈Q ID N0:2)、 nPol-F:5'-GTGTTTCTACATTGCTGG-3'(沈Q ID N0:3)、 nPol-R:5'-CTGTTGGCGTTGACCTTC-3'(SEQ ID N0:4); 本专利技术另一个方面提供一种牡颇瘤疹病毒的巢式PCR检测方法，即首先从待检测 样品中制备反应模板，并配制巢式PCR反应体系，然后通过巢式PCR反应程序对反应模板进 行扩增，最后根据PCR产物琼脂糖凝胶电泳是否产生目的条带对检测结果进行判断，如果显 示目的条带则表示该样品的牡颇瘤疹病毒检测结果为阳性； 具体包括如下的步骤： 步骤1)基因组DNA提取:采用普通动物组织的DNA提取方法，从约30mg的贝类样本 外套膜组织中提取DNA; 步骤2)第一轮PCR扩增：w步骤1)中得到的样本DNA2.0yL为模板，采用化 R引物，经PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物。步骤3)第二轮PCR扩增：W第一轮PCR扩增产物10倍稀释物2.01x1为模板，采用 ηΡο 1-F/吐01-R引物，经PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物。[001引步骤4)PCR扩增产物检测：取4.扣L第二轮PCR扩增产物，加入1.化L的上样缓冲液 (GeneFinder与6X loading buffer按1:9体积混合)混合后，在浓度为1%的琼脂糖凝胶中， 110伏电压下电泳30min;凝胶成像系统观察并拍照，存在约38化P的特异性条带，则确定所 检测的样本被OsHV-1所感染。 其中步骤2)所用PCR反应体系为：DNA聚合酶（抓AiL)0.4yL，10 X PCR buff e巧.0μ 1，(1^口3(2.5111111〇1/1)4.0化，]\%2+(25111111〇1/1)4.化1^，上下游引物（10.0皿〇1/1)各2.0化，0魁 模板2.化L，另外加超纯水30.6化补齐到50化的反应体系。 步骤2)所用PCR反应程序为：首先94°C预变性5min;然后94°C变性30s，53°C变性 30s，72°C延伸45s，35个循环;最后72°C延伸lOmin，4°C保存。\%2+(25.0πιπιο1/1)3.0化，上下游引物（10.0 皿 ol/L)各 2.0化，0魁 模板2.化L，另外加超纯水32.6化补齐到50化的反应体系。 步骤3)所用PCR反应程序为：首先94°C预变性5min;然后94°C变性30s，51°C变性 30s，72°C延伸45s，25个循环；最后72°C延伸lOmin，4°C保存。 本专利技术是W牡颇瘤疹病毒种内严格保守的基因序列为模板设计的两对嵌套式引 物。运些引物可W特异性地与所有牡颇瘤疹病毒变异株基因组相结合，并被经过优化的PCR 反应体系和程序所扩增，完成对不同变异株的检测，克服了之前检测方法只能检测到部分 变异株的严重缺陷。【附图说明】图1:PCR反应退火溫度的优化图，其中（a)第一轮PCR反应；M:DL 2000? DNA marker;!~6 泳道分别为 51、53、55、57、59和61°。（6)第二轮？〔尺反应;]?:01 2000了叫〇麻 marker; 1 ~6泳道分别为 47、49、51、53、55和57°C; 图2:PCR反应灵敏度的测试图，（a)第一轮PCR反应，（b)第二轮PCR反应M:DL 2000? DNA marker;l~8泳道分别为 1〇8、1〇7、1〇6、1〇5、1〇4、1〇3、1〇2和1〇1拷贝/化^; 图3:PCR反应特异性检测图；（a)第一轮PCR反应，（b)第二轮PCR反应;M:DL 2000? DNA marker; 1.牡颇瘤疹病毒；2.副溶血弧菌;3 .对邮肝肠抱虫;4.白斑综合征；5.派琴虫； 6.阴性对照。 图4:不同变异株检测特异性测试图；（a)本专利技术所述巢式PCR检测方法，（b)基于 OsHV-1基因组C区建立的巢式PCR检测方法;M:DL 2000? dm marker;l.阳性对照;2.阴性 对照;3.巧孔扇贝病料(代表变异株1);4.长牡颇病料(代表变异株2) ;5.魅蝴病料(代表变 异株3)。 图5:本专利技术所述巢式PCR检测方法检测不同贝类OsHV-1感染电泳图;M:DL 2000? DNA marker ;1.阳性对照；2-6.2001~2005年采集巧孔扇贝病料;7-11.2013年采集长牡颇 病料;12-16.2012~2015年采集魅蝴病料;17.阴性对照。【具体实施方式】申请人在对DNA聚合酶进行分析后发现其在鲍瘤疹病毒化alioti化erpesvirus 1)、經瘤疹病毒(切prinid herpesvirys3)等多种瘤疹病毒分子中有相对保守的序列。对 OsHV-lS个变异株DNA聚合酶核巧酸序列进行比对，通过基因同源性分析，确定保守性强 (核巧酸组成完全相同）的关键功能结构域，从而建立适用于OsHV-1不同变异株检测方法的 基础。 W下通过附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。[002引实施例1:PCR引物设计 利用Primer 5.0引物设计软件，WDNA聚合酶基因本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测牡蛎疱疹病毒的巢式PCR引物组，其特征在于，所述的引物组的信息如下：Pol‑F：5＇‑GATTTCAACTCGCAATACC‑3＇、Pol‑R：5＇‑GGCAGACACAGATTCCACA‑3＇、nPol‑F：5＇‑GTGTTTCTACATTGCTGG‑3＇、nPol‑R：5＇‑CTGTTGGCGTTGACCTTC‑3＇。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：白昌明，王崇明，高文辉，汪清晨，史杰，张庆利，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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