本发明专利技术公开了一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方法。所述的扩增引物为：F：5’-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3’；R：5’-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3’。提取待测穿山甲的基因组DNA，然后利用所述扩增引物，以待测穿山甲的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，如果扩增不出来片段，则待测穿山甲不是马来穿山甲，如果能够扩增出扩增片段，将扩增片段进行测序，如果扩增片段的核苷酸序列与SEQ ID NO.3所示的序列相同或者相似度达到95％以上，则为马来穿山甲，否则则不是马来穿山甲。本发明专利技术能鉴定是否是马来穿山甲物种，为马来穿山甲的保护遗传学、进化遗传学及其物种的分子鉴定提供基础。
【技术实现步骤摘要】
：本专利技术属于生物化学与分子生物领域，具体涉及一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方法。
技术介绍
：马来穿山甲(Manisjavanica)隶属于鳞甲目、穿山甲科、穿山甲属，主要分布于泰国、马来西亚、缅甸、印尼、新加坡等地，生活在低海拔森林及次生林中。马来穿山甲的鳞片具有很高的药用价值，近年来，过渡猎捕导致马来穿山甲野生资源日益减少，已被IUCN列为极危动物。为了保护野生资源，恢复马来穿山甲野生种群数量，研究其种群遗传结构和野生群体遗传变异水平非常必要。分子标记是在DNA水平上对遗传多样性的直接反映，具有数量多，多态性好，遗传稳定等优势，是研究遗传变异的理想方法。其中，线粒体基因是一个非常有效的遗传标记，与核基因相比,线粒体基因具有母系遗传、结构简单、进化速率快等独特的遗传特性，被广泛应用于物种鉴定和群体遗传多样性等研究。因此，线粒体基因是进行马来穿山甲物种鉴定、群体结构和遗传变异研究的有效工具。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物及鉴定方法，利用该扩增引物，按照本专利技术的鉴定方法能够特异性的扩增出马来穿山甲线粒体Cox3基因，用于鉴定是否是马来穿山甲物种，为马来穿山甲的保护遗传学、进化遗传学及其物种的分子鉴定提供基础。本专利技术的马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为：F：5’-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3’，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；R：5’-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3’，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术的另外一个目的是提供马来穿山甲的鉴定方法，其特征在于，提取待测穿山甲的基因组DNA，然后利用上述扩增引物，以待测穿山甲的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，如果扩增不出来片段，则待测穿山甲不是马来穿山甲，如果能够扩增出扩增片段，将扩增片段进行测序，如果扩增片段的核苷酸序列与SEQIDNO.3所示的序列相同或者相似度达到95％以上，则为马来穿山甲，否则则不是马来穿山甲。按照本专利技术的鉴定方法能够特异性的扩增出马来穿山甲线粒体Cox3基因，用于鉴定是否是马来穿山甲物种，为马来穿山甲的保护遗传学、进化遗传学及其物种的分子鉴定提供基础。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：(1)马来穿山甲基因组DNA的提取剪取马来穿山甲肌肉组织于2mL离心管中，将组织剪碎，加800μL消化缓冲液，10μL蛋白酶K(20mg/mL)，混匀后于55℃消化过夜。消化清透后，加入800μL饱和酚，轻轻颠倒混匀20min，10000g离心10min，抽提上清。加入400μL饱和酚，400μL氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀20min，10000g离心10min，抽提上清。加入800μL氯仿/异戊醇(24:1)，轻轻颠倒混匀20min，10000g离心10min，抽提上清。加入1mL预冷的无水乙醇，于-20℃冷冻2h，12000g离心15min，弃上清。加预冷的70％乙醇，小心洗涤DNA沉淀两次，12000g离心5min，弃上清。晾干乙醇，加入50μL超纯水溶解沉淀，置于-20℃保存备用，得到马来穿山甲基因组DNA。(2)PCR扩增Cox3基因片段上游引物F：5’-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3’；下游引物R：5’-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3’。PCR扩增体系为25μL，包括约10ng步骤(1)获得的马来穿山甲基因组DNA，2.5μL10×PCRbuffer，0.2mMdNTP，上下游引物各0.2μM，0.5UTaq聚合酶(Takara)。PCR扩增条件为：首先94℃预变性5min，然后进行30个循环，每个循环包括94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，最后72℃延伸7min。用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，如果扩增出的片段长度符合预期大小，则该扩增片段为Cox3基因片段。PCR产物纯化后直接进行测序，获得Cox3基因片段的序列信息，马来穿山甲的Cox3基因的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。(3)利用Cox3基因片段的序列信息进行物种鉴定当需要对疑似马来穿山甲的穿山甲样品进行鉴定时。首先提取待测穿山甲的基因组DNA，然后利用上游引物F：5’-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3’；下游引物R：5’-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3’，以待测穿山甲的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，并将扩增片段进行测序，如果扩增片段的核苷酸序列与SEQIDNO.3所示的序列相同或者相似度达到95％以上，则为马来穿山甲，否则则不是马来穿山甲。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为：F：5’‑ATCTGCCCTCCTAATAACATC‑3’；R：5’‑CGAATCCGAAGTGGTGGT‑3’。
【技术特征摘要】
1.一种马来穿山甲线粒体Cox3基因序列的扩增引物，其特征在于，所述的扩增引物为：
F：5’-ATCTGCCCTCCTAATAACATC-3’；
R：5’-CGAATCCGAAGTGGTGGT-3’。
2.一种马来穿山甲的鉴定方法，其特征在于，提取待测穿山甲的基因组DNA，然后利用权
利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：龚世平，李伟业，滑溜帅，葛研，王付民，侯方晖，
申请(专利权)人：广东省昆虫研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44
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