构建高成骨活性骨的方法技术

本发明专利技术涉及一种构建高成骨活性骨的方法，有以下步骤：1)取同种异体骨脱钙骨支架；融合肽溶解在蔗糖溶液中，至溶液的终浓度为1％，超声处理，得到肽溶液；2)取同种异体脱钙骨支架完全浸泡在肽溶液中4-8分钟，取出，用磷酸缓冲盐溶液冲洗，得到自组装肽修饰的同种异体脱钙骨支架材料；3)将骨髓注入装填有自组装肽修饰的同种异体骨脱钙骨支架材料的骨生长富集器中，骨髓富集若干次，得到高成骨活性骨。该方法能使同种异体骨支架材料高效率富集可促进骨再生细胞，满足成骨的需要，得到的是高成骨活性骨移植材料。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物医学的骨基质材料，特别涉及一种构建高成骨活性骨的方 法。
技术介绍
因外伤、感染、肿瘤等各种原因所致的骨缺损十分常见，骨修复过程，是一个多蛋 白、多因子协调作用的复杂调控过程。 同种异体骨(DBM)是目前最常用的组织工程骨支架材料，经过深低温冻存、脱脂、 脱功能蛋白、脱钙、γ射线辐照等一系列处理后，有极小的免疫源性，因其天然的三维空间 结构、一定的骨诱导活性等是一种理想的组织工程骨支架材料。 在组织工程骨成骨修复中，可促进骨再生的细胞和细胞因子在骨支架中的浓度， 对于成骨有着非常重要的作用。 骨髓、血液等组织液中含有一些可促进骨再生的细胞和细胞因子。这些细胞和因 子除了具有一定的体积之外还具有一定的表面电荷。通常，为了提高支架材料中上述成份 的浓度，采用缩小支架材料孔径的方法提高富集效率。但是，这种方法富集效率虽有提高， 但是富集的倍数局限在1.5-2倍左右，难以满足成骨的需要，而且对体积很小的细胞因子富 集效果不佳。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，该方法能使同种异体骨支架 材料高效率富集可促进骨再生细胞，满足成骨的需要，得到的是高成骨活性骨移植材料。 本专利技术的技术方案是： ，有以下步骤： 1)富集材料的制备 取同种异体骨脱钙骨支架； 纯度2 95%的融合肽，溶解在20%蔗糖溶液中，至溶液的终浓度为1 %，超声处理 30分钟，得到肽溶液； 2)取脱同种异体妈骨支架完全浸泡在肽溶液中4-8分钟，取出，用pH值7.4的磷酸 缓冲盐溶液冲洗，得到自组装肽修饰的同种异体脱钙骨支架材料； 3)富集 将骨髓注入装填有自组装肽修饰的同种异体骨脱钙骨支架材料的骨生长富集器 中，骨髓富集若干次，得到构建高成骨活性骨材料。 所述融合肽包含RADA16-I肽和偶联于RADA16-I肽序列的C端的osteostatin肽 (TRSAW)，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示;或者所述融合肽包含由RADA16-I肽序列的C端 经由氨基酸残基GG与osteostatin肽(TRSAW)偶联形成，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。 所述RADA16-I肽的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。 所述osteostatin肽的序列如SEQ ID N0:4所示。 步骤3)所述的骨髓富集为4次。本专利技术采用〃物理化学双修饰〃，利用纳米级自组装肽RADA16-I，等带有一定电荷 的材料来修饰同种异体骨等孔径较大的支架材料，纳米级自组装肽等材料凝固在支架材料 的表面可以减小材料的孔径，提高富集效率；同时，凝固在支架材料表面的纳米级自组装肽 还带有一定电荷的集团，可以通过电荷间的相互作用提高对同样带有不同电荷的细胞和细 胞因子的吸附作用，进一步提高富集效果，提高富集材料中的细胞和因子的浓度，进一步提 高成骨能力。【附图说明】图1为空白DBM材料呈三维网状结构图；图2为融合肽/DBM复合材料在DBM表面及网孔内部形成片状结构图；图3为融合肽/DBM复合材料在DBM表面及网孔内部形成丝状结构图；图4为未修饰的DBM支架的扫描电镜图片； 图5为修饰的融合肽/DBM复合材料内部可见网孔状的结构及其内部大量的富集细 胞； 图6为修饰的融合肽/DBM复合材料富集细胞的放大图像。【具体实施方式】 -.试剂和仪器 1.试剂： 同种异体脱钙骨支架样本(北京大清技术有限公司，中国） RADA16-I肽和融合肽(强耀生物有限责任公司，上海，中国） FACSCal ibur流式细胞分析仪(BD公司，美国） 溶血素南昌百特生物高新技术有限公司 混试剂CD34-PE，CD45-Per CP,nucleic acid dye,(有核细胞）核酸染料(BD公司，美国） 2.仪器 超声波清洁器K5100(昆山有限责任公司，上海，中国） 骨生长富集器(重庆市富沃思医疗器械有限公司，中国）生物晶片扫描器(美国Axon仪器公司）实施例1多肽的设计 以RADA16-I肽，序列为SEQ ID N0:1(AcN-RADARADARADARADA-C0NH2)作为基础，在 其C末端借肽键直接偶联一段osteostatin肽(TRSAW)，该多肽(融合肽)氨基酸序列为SEQ ID N0:2(RADARADARADARADAGGTRSAW)，分子量为2387.54;或者在1^0416-1肽的(：端经两个 氨基酸残基GG与osteostatin肽(TRSAW)偶联，该多肽(融合肽)氨基酸序列为SEQ ID NO: 3 (RADARADARADARADAGGWASRT)，上述多肽均由苏州强耀生物科技有限公司合成。 实施例2富集材料的制备 将同种异体骨脱钙骨支架(DBM)样本切成立方体(10X10X5mm，，备用。取实施例1 所述的多肽(所述多肽均可以达到本专利技术所述技术效果），本实施例采用SEQ ID N0:2,纯度 2 95%，溶解在20 %蔗糖溶液中，最终浓度为1 % (w/v)，用超声波清洁器进行超声处理30分 钟以降低肽的粘滞性。DBM完全浸泡在肽溶液中约5分钟。取出DBM后用足量的磷酸缓冲盐溶 液(PBS，pH值7.4)冲洗，即完成肽的自组装，形成自组装肽修饰的DBM材料(SAP/DBM)。实施例3富集将骨髓注入已装填骨修复材料的椎杯中，盖紧外盖，均匀用力按压骨生长富集器 手柄至平齐顶部后松开，本产品在恒力弹簧提供的负压作用下，自动完成1次骨髓富集操 作，并将骨髓回吸入回流筒中。待骨髓完全回流、手柄恢复到初始位置后，再次按压手柄开 始第二次循环。累计4次上述富集操作，即完成高成骨活性骨移植材料的构建，总过程约5-10分钟。富集材料的孔径指标观察：富集材料制备后通过三维视频显微镜图像分析系统测 定未修饰的DBM孔径大小为(414.32±175.00)μπι(标本数量为η = 60)，修饰后的支架材料融 合肽/DBM材料孔径大小为(220.55±158.54)μπι(η = 60)，二者之间具有显著的差异。具体图 像见图1(未修饰的DBM)和图2(融合肽修饰的DBM)。支架材料的孔径被缩小后，可以形成滤 筛一样的效应，可以显著提高支架材料对骨髓中细胞等促进成骨的成分的滞留。实施例4富集效果评价 1.富集细胞的计数(FA当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建高成骨活性骨的方法，其特征在于，有以下步骤：1)富集材料的制备取同种异体骨脱钙骨支架；纯度≥95％的融合肽，溶解在20％蔗糖溶液中，至溶液的终浓度为1％，超声处理30分钟，得到肽溶液；2)取同种异体脱钙骨支架完全浸泡在肽溶液中4‑8分钟，取出，用pH值7.4的磷酸缓冲盐溶液冲洗，得到自组装肽修饰的同种异体脱钙骨支架材料；3)富集将骨髓注入装填有自组装肽修饰的同种异体骨脱钙骨支架材料的骨生长富集器中，骨髓富集若干次，得到高成骨活性骨。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯天勇，陈贝克，李志强，邢军超，罗飞，张帅，许建中，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85