本发明专利技术公开了一种pAPN基因定点修饰猪，其采用基因工程的方法构建猪氨肽酶N(porcine aminopeptidase N，pAPN)的基因载体；通过细胞转染等多种技术获得pAPN基因定点修饰猪。本发明专利技术主要有两点应用：1、从遗传的角度根除猪病毒性腹泻和K88的感染，减少养猪的疫病控制成本，减少其对环境的污染，为健康养殖和减少抗生素的滥用提供一种方法；2、该定点修饰猪为研究人类癌症等相关疾病的发病机制及相关干预与治疗的筛选与临床前预试。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及动物基因工程
，尤其设及一种pAPN基因定点修饰猪。
技术介绍
1、仔猪腹泻病带来的损失巨大 仔猪腹泻病是集约化养猪生产条件下一种常发的、典型的由多因素导致的疾病。 近年来，我国仔猪腹泻病发病率与死亡率居高不下，不少猪场的死亡率几乎是100%，造成 了极大地经济损失。据不完全统计，2014年我国存栏母猪约4500万头，年产仔猪近8亿头，但 最后上市的猪大约只有80%，猪在不同阶段的死亡率达20%，其中约有一半是由于腹泻病 导致的。因此，仔猪腹泻病对养猪业来说危害极大。 2、仔猪腹泻病病原 猪腹泻病病原种类繁多，致病性复杂，有细菌性的、病毒性的及寄生虫等，其中，由 病毒和大肠杆菌感染仔猪而引起的腹泻呈现为高发病率和高死亡率。就病毒性腹泻而言， 目前认为猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪流行 性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirusj邸V)是致使初生仔猪和断奶仔猪发生腹 泻最常见和最重要的病毒。猪传染性胃肠炎病毒是引起仔猪腹泻的重要病原之一，尤其是 对1-2周龄仔猪致死率可达100%(Ren et al 2008)。病毒性腹泻造成的损失也极其严重， 2010冬至2012年初，病毒性腹泻给全国各地规模猪场造成了很高的发病率和死亡率，仅在 南方就有超过100万头仔猪死于腹泻(Sun et al 2012)。而对于细菌性腹泻，K88和F18大肠 杆菌是导致初生仔猪和断奶仔猪腹泻最常见和最重要的细菌性病原菌。但是，该病的防治 主要W抗生素为主，但是效果极差，加之抗生素的滥用对食品卫生健康造成的危害较大。因 此，培育一种抗仔猪腹泻病的猪对于防控仔猪腹泻病，保障养猪业健康发展具有重要意义。 3、猪APN的功能和作用 病毒猪胃肠炎病毒(TGEV)和猪流行性腹泻病毒(P邸V)同属于I型冠状病毒。目前， 大多数冠状病毒成员的细胞表面受体已被鉴定出并呈现一定规律性。在I型冠状病毒中，大 多数病毒的雙体为氨肤酶N(aminopeptidaseN，APN);II型冠状病毒雙体为W9-0-乙酷唾 液酸;而SARS-CoV的功能性受体是血管紧张素转移酶(ACE2)。[000引 1963年，Pf leiderer和Celliers从猪的肾脏中分离得到猪氨肤酶N(Pf leidererfe Celliers 1963) ,1989年根据cDNA克隆序列对比确定了APN即为细胞表面的促分化抗原 CD13XD13/APN的酶活性表现为从小肤段N端切除氨基酸，故又名氨肤酶N。猪氨肤酶N是含 有Zn2 +的膜结合型外肤酶，属于依赖锋离子的金属蛋白酶Ml家族，pAPN基因 cDNA全长 2892bp，含有20个外显子，编码964个氨基酸，分子量约为150W)a，广泛存在于多种组织和细 胞中，尤其在小肠黏膜上高效表达，该蛋白通过近N端的螺旋产生跨膜作用进入细胞膜，使 pAPN能够固定在细胞上，且有一部分N端肤链的单个氨基能够通过催化作用进入细胞浆，从 而发挥其功能。由于pAPN基因具有重要的作用，其晶体结构也已被解析出来(畑en et al 2012)，但是其作用的基因调控网络未见有报道。 免疫学和体外研究表明pAPN是TGEV和阳DV等病毒的主要受体，宿主pAPN表达量的 高低在一定程度上决定了病毒感染程度的强弱化elmas et al 1994，Delmas et al 1992， Delmas et al 1993，Li et al 2007，Nam&Lee 2010,李宝贤et al 2009)〇TGEV感染过程中 病毒S蛋白与受体pAPN发生特异性结合的位置是pAPN上第717-813位氨基酸(Bridgen et al 1993) dPEDV感染过程中病毒S蛋白与受体pAPN发生特异性结合的位置是pAPN上第500- 963位氨基酸(单智夫2012)。 Me化ebeek等利用某种特殊的神经氨酸酶处理刷状缘细胞后，受体的α(2-3)，α(6- 8)唾液酸结合位点发生了明显的变化，表现为pAPN与肠道内K88ac菌毛的黏附明显减少 (Me化ebeek et al 2012)eSnoeck等的研究证实，pAPN可W促进小肠上皮细胞内吞K88ac菌 毛并且能够诱导黏膜免疫的发生（Snoeck et al 2008)。有研究表明，K88ac是通过网格蛋 白介导的细胞吞隧作用内陷入IPEC-J2细胞（Rasschaert et al 2010)。]\^化66664等还通 过口服pAPN的抑制剂来研究pAPN的功能，实验表明，即使在没有佐剂或辅助性物质存在的 情况下，pAPN也可W引起肠道强烈的黏膜免疫反应，并产生数量较多的IgAJgG抗体，甚至 连初次免疫后产生的IgM抗体也可检测到(Melkebeek et al 2012)，即使是远低于可检测 水平的pAPN也可W促进肠上皮细胞的吞隧作用，并能够诱导一定的免疫应答，运一结果表 明pAPN是疫苗抗原祀向穿越上皮细胞屏障的作用祀标(Devriendt et al 2012)。综上所 述，pAPN还可能是K88ac受体的候选蛋白。 我们前期的研究显示pAPN基因在肾脏和空肠中表达最高，仔猪在7日龄表达量最 高，且运正好与腹泻病毒及K88感染的流行病学呈高度相关。在细胞系上pAPN表达水平的高 低与病毒感染的强弱呈正相关，高表达pAPN的ST细胞和成纤维细胞对TGEV的敏感性要远大 于低表达pAPN的IPEC-J2细胞，且攻毒后高表达pAPN的ST和成纤维细胞出现明显的细胞病 变(细胞皱缩、变圆、脱壁、死亡）。运些研究在很大程度上也证明了pAPN在仔猪腹泻病的发 生中起着十分重要的作用。 4、人APN的功能和作用 APN在人体内广泛表达，存在于多种细胞表面，是一种锋离子依赖的金属蛋白酶 化C3.4.11.2)，主要参与细胞生长、信号转导、免疫调节、肿瘤侵袭、血管新生W及病毒感染 等病理生理过程。有研究表明其在肿瘤细胞表面高水平表达，是一种重要的肿瘤细胞标记 物功能蛋白（Jeffe巧2003) dAPN还是血管生成的重要调节因子，正常血管内皮细胞上的 APN未被激活，而在肿瘤新生血管的内皮细胞上，APN高度表达（Curnis et al 2000， Pasqualini et al 2000,van Hensbergen et al 2002)。因此，抑制APN的活性可W有效的 预防和控制肿瘤的侵袭与转移。随着对APN研究的不断深入，WAPN为祀点来设计抑制剂已 经成为抗肿瘤药物的研究热点已有多种抗肿瘤药物上市，如师enimex(即乌苯美司胶囊）， 本药于1987年在日本上市，1998年在中国上市，为国家二类抗肿瘤新药。猪作为疾病模型较 小鼠等具有诸多的优势，建立pAPN基因敲除猪模型，可能对研究其具体的分子作用机制起 到重要作用，也有可能获得针对恶性血液病、肿瘤、免疫相关性W及某些冠状病毒感染性疾 病等多种疾病的新疗法，因而可能具有较为广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种pAPN基因定点修饰猪。 为了解决上述技术问题，本本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种pAPN基因定点修饰猪，包括以下步骤：(1)pAPN基因的克隆与序列分析利用pAPN的基因组和cDNA序列信息，设计引物进行克隆，利用高保真DNA聚合酶扩增目的片段，克隆至表达载体后，进行测序，对其基因组序列和cDNA序列进行分析，检测其变异位点；(2)pAPN基因编辑载体的构建与活性分析及Donor载体的构建①pAPN基因编辑载体的构建：利用pAPN基因组序列信息及变异位点分析数据，选取其第一外显子为靶序列，设计2对TALE蛋白识别序列，分别克隆至pTALEN‑01载体中；②pAPN基因Donor载体的构建：为提高载体的构建效率，本载体在构建过程中采用一步定向克隆法进行克隆，首先将合成的两对同向LoxP克隆入pDonor‑TN01载体中；然后针对2对TALE蛋白识别序列设计左右同源臂，利用高保真酶对同源臂进行扩增；使用一步定向克隆法将左右同源臂和LoxP和筛选标记克隆入载体，形成最终的porcine aminopeptidase N基因的Donor载体，命名为pDonor‑001；③靶点活性验证：将构建的若干对pAPN TALEN质粒、及实验室保存的CMV‑PG03‑Stop和GLuc donor载体共转染至293T细胞中，转染48h后，收集细胞上清液，使用Secrete‑PairTM双荧光素酶报告系统分析TALEN对的活性；(3)pAPN基因定点修饰ST细胞系的建立与TGEV致病性研究④pAPN基因定点修饰ST细胞系的建立：培养细胞待ST细胞生长至80％汇合时，消化细胞使用电转染法进行转染，TALEN左臂质粒：右臂质粒：Donor质粒按照一定的比列进行转染，48h后观察绿色荧光的比例以确定转染效率，消化后进行培养，加入终浓度为1.6μg/mL的puromycin进行筛选，为提高阳性率以高浓度持续筛选10天后，使得培养皿中的克隆数不多于5个，且克隆之间距离较大生长状态良好，挑选单克隆进行扩增，得到的转基因细胞扩增并进行一系列的鉴定；pAPN重组左臂扩增大小为1177bp，上游引物：AGAAGGGAAGGATTTTGAGGTTC，下游引物：ACTTATATACGGTTCTCCCCCA，pAPN重组右臂扩增大小为1455bp，上游引物：TCAGAAGCTATCTGGTCTCCCT，下游引物：TCACCTTTGGGCGGCATATT；PCR扩增目的基因片段，并进行测序验证；⑤ST定点修饰细胞的攻毒：利用上述获得的pAPN基因定点修饰ST细胞和对照组ST细胞将等量的TGEV病毒感染细胞，共同孵育6h后，PBS洗涤3次，将一部分细胞提取RNA后，反转录成cDNA，使用荧光定量PCR检测其表达；通过以上手段评估pAPN基因定点修饰ST细胞的抗病毒效果；评估后发现敲除细胞具有明显的抗病毒作用；(4)pAPN基因定点修饰成纤维转基因细胞系的建立与重构胚的获取⑥pAPN基因定点修饰成纤维细胞系的建立：方法同步骤(3)中④；⑦重构胚的获取：将从屠宰场摘取的猪卵巢运回实验室，抽取卵巢上3‑6mm直径的卵泡，挑选胞质均匀，包裹完整并且带有2层以上卵丘细胞的卵母细胞复合体后，转入到成熟培养滴中培养42±2h后，进行脱卵丘，挑选排出第一极体且卵周隙明显的卵母细胞；用盲吸法去核后，进行核移植，操作完成后将重构胚转移到石蜡油覆盖好的T2液滴中，38.5℃恒温培养30min，将T2中已恢复好的重构卵在化学辅助激活液中激活10min，然后融合，将融合的重构胚置于PZM3中进行培养；(5)pAPN基因定点修饰猪的获得与鉴定选用发情良好、体型较好的母猪为受体，将重构1天后的胚胎移植到自然发情后1天的母猪输卵管中，调整饲养管理，直至克隆猪出生；获得定点修饰的猪。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈建文，张运海，李运生，潘开源，韩春杨，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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