本文中公开了含有处于多聚体结构的MERS病毒蛋白的纳米颗粒，和为了以免疫原性组合物施用而配制的含有该纳米颗粒的组合物。本文中还提供了编码该蛋白的载体构建体，和含有该载体构建体的宿主细胞。公开内容还包括生成该纳米颗粒和对脊椎动物施用它们的方法，包括诱导针对MERS的免疫应答的方法，所述免疫应答降低或防止受病毒的感染。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 对相关申请的交叉引用 本申请要求2013年9月19日提交的美国临时申请No. 61 /880，111的权益，通过提及 将其完整收入本文用于所有目的。 电子提交的文本文件的描述 通过提及将与本文一起电子提交的文本文件的内容完整收入本文:序列表的计算 机可读形式拷贝（文件名:N0VV-056/0lW0_Seqlist. txt，记录日期:2014年9月18日，文件大 小：17,384兆字节）。 专利技术背景 冠状病毒能在动物(诸如人）中引起疾病。SARS(重度急性呼吸综合征)是此类疾病 的一个例子。最近，已经出现了一种新的冠状病毒，即中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)，它与人死亡有关。MERS-CoV已经被世界卫生组织(WHO)鉴定为"威胁全球健康"，并且 已经在中东和欧洲的21个国家得到报告。MERS-CoV是一种高致病性呼吸系统病毒，其在受 感染的个体中引起重度呼吸窘迫和潜在的肾衰竭。 冠状病毒经由其在病毒体表面上的刺突（S)糖蛋白与其在宿主细胞上的关联受体 (例如二肽基肽酶4(DPP4)，其在多种人细胞上找到，包括肺和肾细胞)的相互作用附着于细 胞膜。S糖蛋白由含有受体结合域(RK))的N端Sl域和负责病毒-细胞融合的S2域组成。MERS-CoV RBD由核心域组成，所述核心域已经与人DPP4蛋白共结晶，这显示了它与DPP4的叶片 (blade)4和5相互作用。在其它冠状病毒(包括SARS-CoV)中，针对RBD的抗体能够在体 外中和病毒并抑制病毒的生长。在SARS-CoV的小鼠模型中，已经证明了疫苗诱导并 被动转移的中和性抗体有效抑制肺发病和死亡。然而，已经报告了在体外人免疫细胞 中对SARS CoV的抗体依赖性增强(ADE)，尽管其在体内的临床意义是未知的。 已经使用人康复期血浆和/或免疫球蛋白来有效预防和治疗许多病毒传染原。英格兰公共卫生部门（Public Health England)和国际重度急性呼吸系统和新兴感 染协会（International Severe Acute Respiratory&Emerging Infection Consortium) (ISARIC)将中和性抗体(包括康复期血浆）的被动免疫疗法鉴定为保证优先研究的MERS-CoV治疗方法。然而，生成具有高亲和力和亲合力抗体的大量抗病原体人血浆和/或免疫球 蛋白目前需要康复期患者的捐献，这会出于许多文化、基础设施和后勤原因而限制这些人 衍生产品的广泛利用度。需要快速生成特异性人多克隆免疫球蛋白以预防和治疗传染原 (包括MERS-CoV)的备选手段。 专利技术概述 本文中公开了用于刺激针对冠状病毒(CoV)感染的免疫应答的组合物和方法，所 述冠状病毒(CoV)引起中东呼吸综合征(MERS-CoV)。本公开内容提供了免疫原性并且针对 MERS-Co V感染提供保护的组合物。有利地，组合物诱导针对MERS-CoV的中和性抗体，并且可 以作为疫苗使用。 本公开内容还提供了在对MERS-CoV易感的动物中诱导针对病毒感染的实质性免 疫力的方法，其包括施用至少一个有效剂量的包含MERS-CoV纳米颗粒的疫苗。在一个实施 方案中，所述方法包括对动物口服、皮内、鼻内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下施用所述纳 米颗粒。在各方面中，纳米颗粒仅含有一类MERS-CoV蛋白。在具体的方面中，唯一的蛋白是 刺突(S)蛋白。在一个方面中，本公开内容提供了包含MERS-CoV纳米颗粒的免疫原性组合物，其 中纳米颗粒包含刺突多肽的至少一个三聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含所述刺 突多肽的至少约5个三聚体至约30个三聚体。在另一个实施方案中，纳米颗粒包含所述刺突 多肽的至少约10个三聚体至约20个三聚体。在一个实施方案中，纳米颗粒的浓度是至少约 20yg/mL至约60yg/mL。在另一个实施方案中，纳米颗粒的浓度是至少约30yg/mL至约50yg/ mL。在又一个实施方案中，刺突多肽包含SEQ ID NO: 2。在还有又一个实施方案中，刺突多肽 由SEQ ID NO:2组成。 在另一个方面中，本公开内容提供了生成高亲和力抗体的方法，其包括对动物施 用包含MERS-CoV纳米颗粒的免疫原性组合物，其中所述纳米颗粒包含刺突多肽的至少一个 三聚体，自所述动物收集血清和/或血浆，并自所述血清和/或血浆纯化抗体。在一个实施方 案中，所述方法进一步包括施用佐剂。在又一个实施方案中，佐剂选自下组:Montanide ISA 206、Quil A、明矾、弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂、和氢氧化铝佐剂。在一个实施方案中，动物 是牛或马。在又一个实施方案中，牛或马动物是转基因动物。 在一个实施方案中，通过用纳米颗粒免疫动物生成的抗体具有介于HT8和HT15之 间的KD。在又一个实施方案中，抗体具有介于约HT 12和HT14之间或介于约HT13和HT14之间 的KD。 在还有另一个方面中，本公开内容包括对人受试者进一步施用经过纯化的通过所 述方法生成的高亲和力抗体。 附图简述图1显示了冠状病毒结构。图2显示了通过实施本文中公开的方法获得的疫苗颗粒。 图3显示了抗MERS抗体和抗SARS抗体分别对本文中公开的MERS CoV纳米颗粒VLP 和SARS CoV纳米颗粒VLP的抗体结合。 图4显示了本文中公开的MERS CoV纳米颗粒VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP的电子显 微照片。 图5显示了在不同时间段，不同剂量，且在有和没有佐剂的情况中本文中公开的 MERS CoV纳米颗粒VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP的免疫方案。图6显示了通过实施本文中公开的方法获得的疫苗颗粒。显示了 26nm蛋白质-蛋白 质胶束的三聚体中装配的MERS刺突蛋白。 图7显示了在将本文中公开的MERS CoV VLP和SARS CoV纳米颗粒VLP免疫入小鼠 中后的中和结果。基质M佐剂是尤其有效的。 图8显示了经密码子优化的MERS CoV刺突核苷酸序列。 图9显示了MERS CoV刺突氨基酸序列。图IOA-C显示了MERS刺突蛋白特异性抗体生成和ELISA滴度。小图A显示了疫苗接 种策略(V记录疫苗接种编号;例如Vl是第一次疫苗接种，v2是第二次疫苗接种等）。小图B显 示了在免疫期里来自个别Tc动物的血清样品中的针对重组MERS-CoV刺突蛋白的抗体滴度， 如通过ELISA测量的。滴度数值(单位/ml)定义为0D450读数比空白高2.5倍时血清样品的最 高稀释度。小图C显示了 SAB-300和SAB-301中的针对重组MRS-CoV刺突蛋白的抗体滴度。滴 度活性数值(单位/mg)定义为0D450读数比空白高2.5倍时Img抗体的最高稀释度。图IlA-B显示了来自荧光降低中和测定法的结果。小图A显示了通过FRNT5q测定法 对接种疫苗的牛血清测试中和。对于每份样品，将检出的MERS-CoV的50 %抑制需要的血清 质量(yg)制图。在用血清的稀释液预处理MERS-CoV后量化感染。在感染后，固定细胞，并用 抗刺突抗体标记以量化与假血清相比仅50 %细胞被感染的水平。小图B显示了 SAB-300和 3八8-301的?8阶5〇测定法结果，对348-300和34本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种免疫原性组合物，其包含MERS‑CoV纳米颗粒，其中所述纳米颗粒包含刺突多肽的至少一个三聚体。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：G·史密斯，Y·刘，M·马萨尔，
申请(专利权)人：诺瓦瓦克斯股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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