本申请涉及一种高龙脑含量龙脑樟培育方法，属于植物组培领域，该方法包括(1)外植体的选择及消毒、(2)浸泡处理、(3)接种培养、(4)增殖培养、(5)生根培养、(6)炼苗移栽。本申请去除诱导培养基的植物激素，在接种之前，采用异戊烯基腺嘌呤溶液对外植体进行浸泡处理，并且在继代过程中，提高了光照强度，延长了光周期，降低了培养温度，同时采用了转换继代培养基的技术手段，达到了增殖速度快、遗传性状稳定、龙脑含量高的优良效果。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组织培养方法，具体涉及。
技术介绍
棒树(Cinnamomum comphora)为棒科棒属常绿乔木树种，是江西省吉安市乡土品种。樟树分为龙脑樟、芳樟、脑樟、油樟、异樟等类型。龙脑樟为以上几种类型中天然分布最少，经济价值最高的树种。通过龙脑樟矮林作业种植而提取的天然右旋龙脑，广泛应用于医药、香精香料和化妆品等行业，具有广阔的市场前景。长期以来对龙脑樟的开发利用多以提取精油为主，过度采伐导致其资源严重破坏，尤其是优树资源趋于枯竭。近年来其人工林发展规模急剧扩大，市场上对于龙脑樟优质苗木的需求不断增长。要加速龙脑樟的产业开发，必须建立规模化的苗木和原料林基地，如何使龙脑樟优良母株的各种优良性状在后代个体中遗传性稳定，提高龙脑樟的龙脑含量，提高成活率和生长整齐度，是实现龙脑樟种苗产业开发、生产关键技术。龙脑樟传统的繁殖是采用种子育苗法，但种子繁殖最大的缺陷是后代个体变异性非常大，母株的诸多优良性状，如高龙脑含量及抗病丰产性能在后代中很难稳定延续。采用组织培养技术不仅能克服上述缺陷，同时在短期内即可获得大量优质苗木。目前龙脑樟的组织培养研究主要集中在无性系的建立、工厂化育苗方面，如CNl 026 30459A，CN102217548A，CN104365476A报道了高含量龙脑的培育方法，在现有技术报道中，通常是在龙脑樟外植体不定芽再生培养基中添加细胞分裂素，而最常用的细胞分裂素为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)，浓度为I?3mg/L;NAA浓度为0.3?0.6mg/L。在这种条件下外植体的不定芽再生效率很低，芽体的质量也较差，降低了龙脑的含量。同时，这些再生体系均存在周期长、再生率不高的问题，严重制约了高龙脑含量研究应用的开展。
技术实现思路
本专利技术针对目前现有技术中的一些问题，提供了。为解决上述技术问题，本专利技术采用的一个技术方案是:提供，包括:(I)外植体的选择及消毒:选取高龙脑含量的龙脑樟单株的萌发芽做为外植体，浸于盛有饱和肥皂水的烧杯中5-10分钟，再用自来水冲洗到基本无泡沫，然后再重复上述浸泡冲洗步骤一次;在超净台中先用75%的乙醇浸泡I分钟，无菌水冲洗2次，用含有两滴吐温80的5%次氯酸钠溶液消毒10-15分钟，无菌水冲洗5次;再用含有两滴吐温80的0.1%的升汞消毒10-15分钟，用无菌水冲洗5次；(2)浸泡处理:将步骤(I)所述的外植体用异戊烯基腺嘌呤溶液浸泡处理；(3)接种培养:将经步骤(2)处理后的外植体，接种到诱导培养基中，培养温度为25+ l°C，llh/d的光周期，光照强度2000LX左右，培养3-7天开始生长，所述诱导培养基为改良MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂7-1 Og/L，pH6.6，培养时间20-25天；(4)增殖培养:将经步骤(3)处理后的外植体转入第一代增殖培养基中使芽增殖，所述第一代增殖培养基为改良MS培养基+6-BA 0.5-0.7mg/L蔗糖30g/L+琼脂7-10g/L，pH6.2;培养温度为20 ± 1°C，光照强度4000-6000Lx，光周期14-18h/d;培养60-100天后，将外植体转入第二代增殖培养基中，所述第二代增殖培养基为MS+6-BA0.3-0.5mg/L+NAA0.Ι-Ο.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7-10g/L，pH6.6;培养温度24 土 1°C，光照强度2000Lx，光周期10-12h/d;培养30天左右；(5)生根培养:将增殖培养得到的小芽转入生根培养基中，将较大的芽竖向劈开一分为二再转入生根培养基中，所述生根培养基为1/2MS+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L，pH6.6，培养温度为24±l°C，12h/d的光周期，光照强度2000Lx左右，20天左右生根，当根长达到3cm左右出瓶； (6)炼苗移栽:先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗4d，然后解开封口膜，炼苗6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24-26°C，前5d湿度控制在80 %左右，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50%。所述改良MS培养基为大量元素含量减少1/4，微量元素含量提高1/3。优选地，步骤(6)所述的基质为蛭石、珍珠岩和椰糠按照体积比1:1: I混合的混合物。优选地，所述炼苗移栽后还包括每隔10天喷施质量百分比0.2%磷酸二氢钾水溶液的步骤，以维持植物所需营养。所述异戊烯基腺嘌呤溶液浓度为4_6mg/L。优选地，所述异戊烯基腺嘌呤溶液浓度为5mg/L。所述步骤(2)浸泡处理的时间为20_40min。优选地，所述步骤(2)浸泡处理的时间为30min。有益效果:本专利技术克服现有技术的不足，取得了以下优异的技术效果:1:本申请创造性地去除诱导培养基的植物激素，而是在接种之前，采用异戊烯基腺嘌呤溶液对外植体进行浸泡处理，因为在研究过程中，专利技术人发现长时间培养外植体不能够用高浓度的植物激素，因为长期高浓度激素培养外植体将导致外植体受伤甚至死亡，而低浓度的植物激素的刺激不定芽再生的作用又不够强，因此，专利技术人对培育方法进行了创新，利用高浓度的异戊烯基腺嘌呤溶液对外植体进行浸泡，给予外植体具有分化能力的细胞相对于普通添加植物激素的培养基更强的刺激，诱导形成更多的不定芽。同时，由于仅是局部短时的浸泡处理，植物激素在细胞中的浓度随后很快降低，减少了在培养后期对所形成的不定芽的发育的负面影响，保证了高含量的龙脑；2、在第一代增殖培养基中，减少激素的种类，仅保留6-BA，同时降低6-BA的浓度，减少对不定芽的刺激，在第二代增值培养基中，增加了 NAA，保证后期增殖的效果；3、在现有技术条件下，龙脑樟增殖培养几代后，开始出现变异，随增殖培养次数增加，变异率呈几何倍数增加，导致培养失败。本专利技术通过增加光照强度，从现有技术的2000Lx左右提高到4000-6000LX;光周期从现有技术的12h/d延长到14-18h/d;增殖培养温度从现有技术的25±1°C降低到20±1°C，达到了以下效果:①抑制了营养生长，促进了芽分化，使增值倍数达到20-25倍;②延长继代周期，减少了继代增殖次数，有效降低了变异率，保证了龙脑樟的遗传稳定性。③大大提高了增值效率，节约了成本，取得了意料不到的效果;4、利用本申请的综合措施，保证了龙脑的高含量，同时没有出现褐化现象。【具体实施方式】下面对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。本专利技术实施例包括:实施例1—种高龙脑含量龙脑樟培育方法，包括:(I)外植体的选择及消毒:选取高龙脑含量的龙脑樟单株的萌发芽做为外植体，浸于盛有饱和肥皂水的烧杯中5分钟，再用自来水冲洗到基本无泡沫，然后再重复上述浸泡冲洗步骤一次;在超净台中先用75%的乙醇浸泡I分钟，无菌水冲洗2次，用含有两滴吐温80的5%次氯酸钠溶液消毒10分钟，无菌水冲洗5次;再用含有两滴吐温80的0.1%的升汞消毒10分钟，用无菌水冲洗5次；(2)浸泡处理:将步骤(I)所述的外植体用4mg/L异戊烯基腺嘌呤溶液浸泡处理20min；(3)接种培养:将经步骤(2)处理后的外植体，接种到诱导培养基中，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高龙脑含量龙脑樟培育方法，其特征在于，包括：(1)外植体的选择及消毒：选取高龙脑含量的龙脑樟单株的萌发芽做为外植体，浸于盛有饱和肥皂水的烧杯中5‑10分钟，再用自来水冲洗到基本无泡沫，然后再重复上述浸泡冲洗步骤一次；在超净台中先用75％的乙醇浸泡1分钟，无菌水冲洗2次，用含有两滴吐温80的5％次氯酸钠溶液消毒10‑15分钟，无菌水冲洗5次；再用含有两滴吐温80的0.1％的升汞消毒10‑15分钟，用无菌水冲洗5次；(2)浸泡处理；将步骤(1)所述的外植体用异戊烯基腺嘌呤溶液浸泡处理；(3)接种培养：将经步骤(2)处理后的外植体，接种到诱导培养基中，培养温度为25±1℃，11h/d的光周期，光照强度2000Lx左右，培养3‑7天开始生长，所述诱导培养基为改良MS培养基+蔗糖30g/L+琼脂7‑10g/L，pH6.6，培养时间20‑25天；(4)增殖培养：将经步骤(3)处理后的外植体转入第一代增殖培养基中使芽增殖，所述第一代增殖培养基为改良MS培养基+6‑BA 0.5‑0.7mg/L蔗糖30g/L+琼脂7‑10g/L，pH6.2；培养温度为20±1℃，光照强度4000‑6000Lx，光周期14‑18h/d；培养60‑100天后，将外植体转入第二代增殖培养基中，所述第二代增殖培养基为MS+6‑BA0.3‑0.5mg/L+NAA0.1‑0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7‑10g/L，pH6.6；培养温度24±1℃，光照强度2000Lx，光周期10‑12h/d；培养30天左右；(5)生根培养：将增殖培养得到的小芽转入生根培养基中，将较大的芽竖向劈开一分为二再转入生根培养基中，所述生根培养基为1/2MS+NAA0.3mg/L+蔗糖20g/L，pH6.6，培养温度为24±1℃，12h/d的光周期，光照强度2000Lx左右，20天左右生根，当根长达到3cm左右出瓶；(6)炼苗移栽：先将培养瓶移至温室，自然条件下炼苗4d，然后解开封口膜，炼苗6d，炼苗完成后取出小苗洗净根部附着的培养基，移栽到经消毒的基质中，温度控制在24‑26℃，前5d湿度控制在80％左右，以后逐渐降低湿度，直至将移栽苗置于自然条件下，炼苗移栽期间适当遮光，使光照强度为自然光的50％。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：文沁，
申请(专利权)人：文沁，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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