姜黄素对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎PPAR-γ和COX-2影响的模型建立方法技术

技术编号:13226811 阅读:214 留言:0更新日期:2016-05-13 10:54
本发明专利技术提供了姜黄素对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎PPAR-γ和COX-2影响的模型建立方法。通过观察姜黄素对DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎的疗效;观察小鼠的体重、粪便性状和隐血情况、临床症状、结肠组织学损伤、宏观表现;测定结肠黏膜层PPARγ、COX-2表达情况,及STAT3mRNA和磷酸化STAT3,探讨姜黄素影响溃疡性结肠炎的可能机制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及溃瘍性结肠炎干预模型建立方法,特别设及姜黄素对DSS诱导的小鼠 溃瘍性结肠炎PPAR- 丫和C0X-2影响的模型建立方法。
技术介绍
溃瘍性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种病因尚不十分清楚的直肠和结肠 慢性非特异性炎症性疾病,病变主要局限于大肠粘膜与粘膜下层,病变成连续性弥漫分布, 范围多自肛端直肠开始,逆行向近段发展,甚至累及全结肠及末端回肠,属于炎症性肠病 (inflammatory boweldisease, IBD)之一。本病呈慢性过程,且大部分患者反复发作,近年 来由于治疗水平提高,病死率已明显下降,但是慢性持续性活动或反复发作频繁,预后较 差,且病程漫长者癌变危险性增加。[000引过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome pro Iif erator-activated receptor,PPAR)是一组具有复杂功能的核受体超家族成员,有PPARa、PPARfVS、PPAR 丫 3种 亚型,分别由不同的基因编码,PPAR是配体调节的转录因子,PPAR 丫由配体激活,主要参与 炎症、免疫反应的调节,有减轻溃瘍性结肠炎患者及结肠炎动物模型的炎症反应作用。 环氧合酶-2 (eye looxygenase-2, C0X-2)是启动子含NF-KB结合位点的一种诱生型 酶,在正常情况下不表达,而在有炎症时高度表达,在UC的发病中起重要作用,C0X-2作为促 炎症介质和促细胞分裂刺激早的反应表达,在慢性结肠炎增加的前列腺素产物依赖于COX-2的活性,C0X-2是催化花生四締酸生成前列腺素 E2(prostaglandin E2,PGE2)的关键酶, PGE2具有扩血管、增加肠黏膜通透性和刺激肠上皮细胞分泌的作用,可能与UC腹痛、腹泻的 发生有关。 STAT是一个重要的细胞内信号转导分子,STAT蛋白质是一个含有STAT1/2/3/4/ 5a/化/6的蛋白质家族,在没有特殊受体刺激时STAT在细胞质中保持无活性形式,与多个炎 症因子的表达相关,它在UC的发病机制中有重要作用。在不同的刺激如细胞因子、生长因 子、激素类等,STAT蛋白质迅速通过酪氨酸憐酸化而被激活。在UC的作用机制中,STAT的家 族成员之一 STAT3在UC发病机制中的重要作用已经在实验研究和临床研究中得到证实。 姜黄素是从姜科植物姜黄中提取的一种色素,为澄黄色结晶粉末,味稍苦,酸性多 酪类物质,主链为不饱和脂族及芳香族基团,大量研究证明它具有抗氧化、抗炎、抗凝、降 月旨、抗动脉粥样硬化、抗衰老消除自由基及抑制肿瘤生长等作用。 溃瘍性结肠炎主要药物治疗有氨基水杨酸制剂,但此类药物不良反应多,且临床 疗效不甚令人满意,而5-ASA新型制剂不良反应明显减少,缺点是价格昂贵,因此需要研发 新的药物,此药既能更好的对溃瘍性结肠炎起良好疗效,同时副作用少且经济实惠。姜黄素 对溃瘍性结肠炎的研究近年来有所进步。由于葡聚糖硫酸钢(DSS)诱导的溃瘍性结肠炎 化C)小鼠与人UC的组织学与临床表现类似,为目前较好的研究人UC的动物模型,DSS诱导模 型之所W在I抓研究中受欢迎是由于它的迅速、简单、再现性、可控制性。本课题通过对正常 小鼠、DSS模型小鼠各组治疗前后的生物行为、病理学、免疫组织化学、分子生物学研究,巧U 定PPAR 丫、C0X-2、STAT3的表达,观察姜黄素对溃瘍性结肠炎的干预作用,探讨姜黄素治疗 溃瘍性结肠炎的可能机制。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题,本专利技术的目的在于提供姜黄素对DSS诱导的小 鼠溃瘍性结肠炎PPAR-丫和C0X-2影响的模型建立方法。通过观察姜黄素对DSS诱导小鼠溃 瘍性结肠炎的疗效;观察小鼠的体重、粪便性状和隐血情况、临床症状、结肠组织学损伤、宏 观表现;测定结肠黏膜层PPAR 丫、C0X-2表达情况,及STAT3mRNA和憐酸化STAT3,探讨姜黄素 影响溃瘍性结肠炎的可能机制。 为达到上述目的,本专利技术的技术方案为:姜黄素对DSS诱导的小鼠溃瘍性结肠炎PPAR- 丫和C0X-2影响的模型建立方法,包 括如下步骤: 步骤一、实验分组与模型制造; 选雌性BALB/c小鼠数十只、体重16-20g,小鼠适应性喂养一周,随机数字表分为A、 B、C、D、E、F六组,每组数目相同; A组:正常对照组,每日自由进饮用水及饲料,每日腹腔注射Iml生理盐水,共7d; B组:模型组,每日自由饮用5%DSS溶液,替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注 射Iml的2.5%乙醇溶液,共7d; C组:地塞米松治疗组,每日饮用5%DSS溶液替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔 注射1次地塞米松针剂,剂量为1.5mg/kg. d,溶于Iml生理盐水,共7d。 L组:姜黄素低剂量组,饮用5%DSS溶液替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注射 姜黄素悬液1次,姜黄素按每日25mg/kg. d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液,共7d。 M组:姜黄素中剂量组,饮用5 %DSS溶液替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注射 姜黄素悬液1次,姜黄素按每日50mg/kg. d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液,共7d。 H组:姜黄素高剂量组,饮用5%DSS溶液替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注射 姜黄素悬液1次,姜黄素按每日lOOmg/kg.d的剂量溶于Iml 2.5%乙醇溶液,共7d。 步骤二、结肠组织取样; 第8天,颈椎脱白处死小鼠,剪开腹腔,游离结肠及远端回肠,取出肛口至盲肠末端 的整个肠段,沿肠系膜纵轴剖开,用冰冷PBS反复冲洗干净,再用清洁滤纸吸干水分。宏观检 查并进行评分后,剪取溃瘍最严重处结肠组织1cm,置于4%甲醒溶液固定,常规石蜡包埋, 切片,留作免疫组化染色。另取两段结肠组织放入低溫冰箱-80°C存放,做RT-PCR和化ISA。 步骤=、观察指标; 观察造模期间每日重点观察小鼠的体重、粪便性状和隐血情况,并进行DAI积分, 粪便/潜血临床症状评分;宏观检查评分;组织损伤评分; 步骤四、生化指标测定; 根据上述积分和评分对检测结果进行定性分析,同时,[002引进一步的,所述步骤一中所选小鼠为60只,每组10只。相对于现有技术,本专利技术的有益效果为: 本专利技术提供了姜黄素对DSS诱导的小鼠溃瘍性结肠炎PPAR- 丫和COX-2影响的模型 建立方法。通过观察姜黄素对DSS诱导小鼠溃瘍性结肠炎的疗效;观察小鼠的体重、粪便性 状和隐血情况、临床症状、结肠组织学损伤、宏观表现;测定结肠黏膜层PPAR 丫、C0X-2表达 情况,及STAT3mRNA和憐酸化STAT3,探讨姜黄素影响溃瘍性结肠炎的可能机制。【附图说明】 图1是本专利技术实施例提供的结肠组织P-STAT3蛋白的表达情况示意图; 图2是本专利技术实施例提供的结肠组织STAT3表达情况(RT-PCR)的示意图; 图3是本专利技术实施例提供的结肠组织光镜下观察化EX200)的示意图; 图4是本专利技术实施例提供的结肠组织PPAR 丫的表达情况(SPX400)的示意图; 图5是本专利技术实施例提供的结肠组织STAT3的表达情况(SPX400)的示意图。【具体实施方式】 下面结合【具体实施方式】对本专利技术技术方案做进一步详细描述: 试验例:[003引本文档来自技高网
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【技术保护点】
姜黄素对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎PPAR‑γ和COX‑2影响的模型建立方法,包括如下步骤:步骤一、实验分组与模型制造;选雌性BALB/c小鼠60只、体重16‑20g,小鼠适应性喂养一周,随机数字表分为A、B、C、D、E、F六组,每组10只;A组:正常对照组,每日自由进饮用水及饲料,每日腹腔注射1ml生理盐水,共7d;B组:模型组,每日自由饮用5%DSS溶液,替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注射1ml的2.5%乙醇溶液,共7d;C组:地塞米松治疗组,每日饮用5%DSS溶液替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注射1次地塞米松针剂,剂量为1.5mg/kg.d,溶于1ml生理盐水,共7d;L组:姜黄素低剂量组,饮用5%DSS溶液替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注射姜黄素悬液1次,姜黄素按每日25mg/kg.d的剂量溶于1ml 2.5%乙醇溶液,共7d;M组:姜黄素中剂量组,饮用5%DSS溶液替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注射姜黄素悬液1次,姜黄素按每日50mg/kg.d的剂量溶于1ml 2.5%乙醇溶液,共7d;H组:姜黄素高剂量组,饮用5%DSS溶液替代饮用水,自由进食饲料,每日腹腔注射姜黄素悬液1次,姜黄素按每日100mg/kg.d的剂量溶于1ml 2.5%乙醇溶液,共7d;步骤二、结肠组织取样;第8天,颈椎脱臼处死小鼠,剪开腹腔,游离结肠及远端回肠, 取出肛门至盲肠末端的整个肠段,沿肠系膜纵轴剖开,用冰冷PBS反复冲洗干净,再用清洁滤纸吸干水分;宏观检查并进行评分后,剪取溃疡最严重处结肠组织1cm,置于4%甲醛溶液固定,常规石蜡包埋,切片,留作免疫组化染色;另取两段结肠组织放入低温冰箱‑80℃存放,做RT‑PCR和ELISA;步骤三、观察指标;观察造模期间每日重点观察小鼠的体重、粪便性状和隐血情况,并进行DAI积分,粪便/潜血临床症状评分;宏观检查评分;组织损伤评分;步骤四、生化指标测定;根据上述积分和评分对检测结果进行定性分析。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员:李昌平李珏宏张超
申请(专利权)人:泸州医学院附属医院
类型:发明
国别省市:四川;51

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