体外再现体内反应的方法技术

本发明专利技术属于生物代谢技术领域，提供了体外再现体内反应的方法，包括：打开计算机，调取数据库内存储的相关体内代谢的动力学参数；针对只含有辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的最小代谢网络系统进行胞内和胞外的对比干实验；针对含有非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的无抑制代谢网络系统进行胞内和胞外的对比实验；在高、中、低三种抑制水平下，得出CI的浓度高低对NCI稳态水平的影响；通过调整该反应过程中酶的含量来模拟基因敲入、敲出实验得出酶量对NCI和反应速率的影响以及抑制机制、辅因子代谢中间物CI、酶的含量、非辅因子代谢中间物NCI对细胞内反应具有影响，进而得出胞外代谢反应系统。本发明专利技术弥补了行业空白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物代谢
，特别涉及一种体外再现体内反应的系统以及在生 物等领域内的应用。
技术介绍
生命体内的代谢过程是表现生命特征的唯一的方式，从基因表达，蛋白质的合成， 到个体的生长，所有生命特征都是通过细胞代谢表现出来。因此了解代谢反应的内在机制 对于揭示生命的全部过程是非常有必要的。 另一方面，体内（in vivo)反应和体外（in vitro)反应的区别是几百年来跨在人 类面前的一条几乎难以逾越的鸿沟。科学家们可以清清楚楚地看见差不多所有的体内反 应，组学数据已经大量积累，但是就是还没有人能够在体外重现一个体内反应系统。人类已 经有能力（至少）部分组装基因组系统，但是还是无法复制在化学上了解近百年的代谢系 统。目前，最前沿的代谢网络理论和方法顶多就是设法逼近细胞反应的某些性质，对"代谢 启动/合成"和"代谢简化"这样的"合成生物学"的方向几乎没有实质性的促进。 目前，"合成生物学"着眼于基因组组装。即便如此，对于独立的细胞而言，基因复 制所需的核苷酸和DNA合成酶只有通过合成代谢方能获得。目前，合成生物学研究者尽量绕 开这一问题，代谢系统采用"借腹怀胎"的方法。 总的来说，胞内代谢反应的理解依然停留在静态理解代谢反应途径方面，而对于 代谢反应网络动态特征的描述很少。 代谢网络包含几千个酶和大量的小分子化合物，这些小分子化合物的数量是在一 千至一万之间。平均来说，每个小分子在胞内的含量都很低，为32uM。胞内必然有某种机制 在保证反应速度的条件下使得胞内代谢物摩尔浓度很低。了解这种机制，将有助于人工复 制代谢网络反应(可用于代谢工程改造），甚至构建非天然的代谢网络系统（可用于合成生 物学）。此外代谢网络大都处于稳态，稳态对于细胞的存活具有重要的意义，在生物工程领 域，稳态是实现生物产品高产的首要前提。 因此，为了解决上述问题，生物代谢
急需一种体外再现体内反应的系统。
技术实现思路
本专利技术提供了一种体外再现体内反应的系统，技术方案如下： 体外再现体内反应的系统，包括如下实验步骤： 步骤一，打开计算机，调取数据库内存储的相关酶反应动力学参数，然后根据体内 反应机理，在计算机中实现体内代谢网络反应； 步骤二，针对只含有辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的最小代谢网络系统进 行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应的浓 度随时间的变化曲线图，得出辅因子代谢中间物CI在体内代谢反应中发挥着全局性的作 用，而且辅因子代谢中间物CI在胞内的摩尔含量位于不太高的稳态，胞内代谢与胞外代谢 相比的产物得率至少100-1000倍； 步骤三，针对含有非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物 的代谢网络系统在零抑制、低抑制、中抑制和高抑制四种抑制水平下进行胞内和胞外的对 比干实验，并且绘制出非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对 应浓度随时间的变化曲线图； 步骤四，通过将步骤三条件下得出的多幅浓度随时间的变化曲线图进行比较，得 出如下结论：（1)引入抑制后的胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持稳态，稳态水 平的高低由抑制强度的高低决定；（2)辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物 NCI能否维持稳态的不可或缺的因素;综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维 持稳态的两个重要因素，两者缺一不可； 步骤五，在高、中、低三种抑制水平下，通过调整CI在系统中的摩尔含量，得出CI的 浓度高低对NCI稳态水平的影响，得出CI浓度越低，NCI稳态时的水平越低； 步骤六，针对步骤三的实验，通过调整该反应过程中酶的含量来模拟基因敲入、敲 出实验，基因敲出实验能够通过设置酶量为零来模拟，得出酶量对非辅因子代谢中间物NCI 的稳态摩尔含量和反应速率具有影响，而且能够定量的计算出代谢流对于不同酶的敏感程 度； 步骤七，根据步骤二、步骤四至步骤六得出的结论，得出与胞内反应相一致的胞外 代谢反应系统，具体如下： 其中，SU2代表底物，谢产物，B和Q代表辅因子代谢物CIJ^Y^Y^Y^Ys、 Y6代表非辅因子代谢物％1也4243^53637 48为相应的酶，糾1^阳1，￥:^[^阳2，￥ 3抑制 E3，Y4 抑制 Ε5，Υ#φ制 E6，Y6 抑制 E7。优选的，在上述体外再现体内反应的系统中，步骤一中根据体内反应机理，在计算 机中实现体内代谢网络反应的具体步骤为： 已知在体内代谢网络中，双底物反应的比例为70-80%，第一、第二底物都过量，那 么在体内代谢网络的反应中能够得到2个底物对酶的亲和性常数Km、l个酶的催化常数kcat 以及最大反应速度Vmax; Vmax = ei,〇Xkcat； 双底物的不可逆反应式为:Si+B-Pi+Q，该反应中包含的基元反应为： 其中，ki,i，ki,-i，ki,2，ki,-2，ki,3，ki,-3ki,4，ki,-4 均为酶反应的速率常数，Si 和 B 表不反 应的底物，Pi和Q表示反应的产物，Ei表示酶4出4出314说表示酶复合物； 根据酶定量守恒定量，总酶量ei, 〇满足如下公式： ei,o = ei+eib+eibsi+eiq ei代表Ε!的摩尔量，eib代表EiB的摩尔量，eibS1代表EiBSi的摩尔量， eiq代表EiQ的摩尔量； 由于上述双底物反应式中 为不可逆反应，因 此，ki，-3 = kl，-4 = 0; P1的生成速率的具体计算公式为：其中，代表Pi的生成速率，S1代表底的摩尔量，b代表底物B的摩尔量，由公 式（1)可知，除了 由底物B和Si确定外，还由kl,l，kl,-l，kl,2，kl,-2，1^1,3，1^1,4和61,()确定；其中，Kmb表示底物B对酶的亲和性常数，并且Kmb越大，代表底物B对酶的亲和性越 低；其中，kcat表示酶的催化常数，并且kcat越大，代表没得催化效率越高；其中，Kmsl表示底物3:对酶的亲和性常数，并且Kmsl越大，代表底物Si对酶的亲和性 越低；首先，假设S1>>b，同时将公式(2)和(3)代入公式公式(1)中，得出：然后，将公式(3)除以公式(2)，得出k1;1，具体如下：由公式(6)可知，k1;1为固定值； 进一步地，假设b>>S1，同时将公式(2)和(3)代入公式公式(1)中，得出： 进一步地，将公式(2)、（3)和(4)代入公式(1)中，得出：由公式(8)可知，除了由底物8和51确定外，还由总酶量ei,〇、酶的催化常数k cat、 底物对酶的亲和性常数Kmsl、Kmb以及酶反应的速率常数h,^确定；因此，在给定底物浓度 S1、 13以及产物的生成速率7^.1.1时，能够得出61,〇，1^。 ￡11；，1(1^1，1(1111)，&11(11^1,-1的关系式，进而从计算机 的数据库内提取出满足61,0，1^^，1( 1^1，1(1111)，311(11^1,-1的关系式酶反应动力学参数 ；由公式（3)可知，在kc；at求得后，通过任意调整ki,3和ki,4的值，使其满足％的定值 即可；将公式(4)除以公式(3)，得出： 由公式(9)可知，在满足Kmsl和kcat-定的本文档来自技高网...

【技术保护点】
体外再现体内反应的系统，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，打开计算机，调取数据库内存储的相关酶反应动力学参数，然后根据体内反应机理，在计算机中实现体内代谢网络反应；步骤二，针对只含有辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的最小代谢网络系统进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应的浓度随时间的变化曲线图，得出辅因子代谢中间物CI在体内代谢反应中发挥着全局性的作用，而且辅因子代谢中间物CI在胞内的摩尔含量位于不太高的稳态，胞内代谢与胞外代谢相比的产物得率至少100‑1000倍；步骤三，针对含有非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、酶、底物和产物的代谢网络系统在零抑制、低抑制、中抑制和高抑制四种抑制水平下进行胞内和胞外的对比干实验，并且绘制出非辅因子代谢中间物NCI、辅因子代谢中间物CI、底物以及产物其对应浓度随时间的变化曲线图；步骤四，通过将步骤三条件下得出的多幅浓度随时间的变化曲线图进行比较，得出如下结论：(1)引入抑制后的胞内反应的非辅因子代谢中间物NCI都能维持稳态，稳态水平的高低由抑制强度的高低决定；(2)辅因子代谢中间物CI的存在是非辅因子代谢中间物NCI能否维持稳态的不可或缺的因素；综上所述，抑制机制和CI的全局性作用是胞内网络维持稳态的两个重要因素，两者缺一不可；步骤五，在高、中、低三种抑制水平下，通过调整CI在系统中的摩尔含量，得出CI的浓度高低对NCI稳态水平的影响，得出CI浓度越低，NCI稳态时的水平越低；步骤六，针对所述步骤三的实验，通过调整该反应过程中酶的含量来模拟基因敲入、敲出实验，基因敲出实验能够通过设置酶量为零来模拟，得出酶量对非辅因子代谢中间物NCI的稳态摩尔含量和反应速率具有影响，而且能够定量的计算出代谢流对于不同酶的敏感程度；步骤七，根据所述步骤二、步骤四至步骤六得出的结论，得出与胞内反应相一致的胞外代谢反应系统，具体如下：其中，S1、S2代表底物，P1、P2代谢产物，B和Q代表辅因子代谢物CI，Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6代表非辅因子代谢物NCI，E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7、E8为相应的酶，Y1抑制E1，Y2抑制E2，Y3抑制E3，Y4抑制E5，Y5抑制E6，Y6抑制E7。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：关岳，杨艳，张丽梅，庄英萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31