一种基因组DNA序列精准编辑方法技术

本发明专利技术提供了一种基因组DNA序列精准编辑方法，联合利用TALEN、CRISPR/Cas9等基因打靶技术和同源重组技术对基因组DNA序列精准编辑。本方法解决了现有技术中无法删除某特定序列等技术难点，能够定点、无缝隙地插入或删除特定的碱基序列，首次实现了真核细胞基因组DNA序列无缝隙的任意改造。

【技术实现步骤摘要】

： 本专利技术涉及一种基因组DNA序列精准编辑方法。具体涉及联合利用基因打靶技术 和传统的同源重组技术，定点并无缝隙地插入或删除基因组中特定的碱基序列的方法。
技术介绍
： 在基因工程领域，研究人员们一直在试图修饰基因组的碱基序列，以求失活某个 基因与获得某个新基因的功能。 大肠杆菌同源重组是20世纪90年代末发展起来的一种新的基因工程技术，可以不 必依赖限制性酶切位点，而定点精确地完成诸如片段插入、删除及序列改变等等基因改造。 大肠杆菌同源重组技术常用于染色体DNA的靶向修饰-基因敲入与敲除，以及空隙修复 (gap-repair)方式获取目的基因。原理是以PCR方法合成两侧50-70bp的短同源序列，然后 通过细菌内同源重组将短同源序列间的片段插入基因的目标位置或套取相应的基因目标 片段。申请人曾于1999年利用大肠杆菌同源重组技术成功敲除了细菌与铁代谢有关的cyay 基因 （Li et al .Knock-out of the cyay gene in Escherichiacoli does not affect cellular iron content and seneitivity to oxidants.FEBS Letters 1999,456:13-6)〇 但是，利用同源基因重组技术，突变率非常低，甚至不到万分之一，仅适用于繁殖 较快单细胞生物，如细菌，可以利用某种抗菌素的活性进行大量筛选。 基因打靶技术是另一种用于基因组定点改造的技术。近年来有较大发展，如2011 年，Daniel等（Daniel F , et al . Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic Acids Res 2011,39:6315-25)将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶 融合，推出与（ZFNs)同类型的双链DNA剪刀，称之为TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease)。2012年，Jinek等又报道一种更为简单、高效和低成本的基因打革巴工 具--CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 (CRISPR associated)革巴向基因改造(敲除、敲入)技术(Jinek M，et al .A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science 2012, 337(6096):816-21)。 然而，基因打靶技术的发展仅仅局限于提高基因打靶效率，而不能提高基因打靶 的精准性以及突变的可控性。即，仅能将打靶的位点定位在某个基因的某个区域(通常为 数个或数十个碱基），而且，突变的内容是随机发生，有时插入了一些碱基，有时缺失了一些 碱基，插入或缺失的碱基数目也不能随意控制。无法满足基因工程有时需要精准修饰某个 基因的需求。 因此，对基因突变精准定点，并且对突变(删除或插入）的内容实现完全任意可控， 对两个等位基因进行同样修饰或改造等DNA序列精准编辑技术的开发，非常有必要。 目前尚未见到有关将同源基因重组技术和基因打靶技术结合，用于对基因组DNA 序列精准编辑。由于这两种技术的原理完全不同，而且，依据现有DNA修复的理论知识，即使 二者联合，仅能插入某特定序列，却无法删除某特定序列。
技术实现思路
： 本专利技术的目的是提供一种基因组DNA序列精准编辑技术，实现可精准定点、无缝隙 地插入或删除特定的碱基序列。 本专利技术联合利用基因打祀技术(包括TALEN、CRISPR/Cas9等)和传统的同源重组技 术实现了上述专利技术目的。 所述TALEN或CRISPR/Cas9是本领域公认的普遍熟知的术语，TALEN或CRISPR/Cas9 是能够特异性地分别与靶点的两侧或单侧结合，从而导致靶点处DAN双链断开的质粒。其 中，TALEN是一对质粒，CRISPR/Cas9是单质粒。 2011 年，Daniel等（Daniel F，et al.Modularly assembled designer TAL effector nucleases for targeted gene knockout and gene replacement in eukaryotes.Nucleic Acids Res 2011,39:6315-25)将TALE DNA结合motif与FokI核酸酶 融合，推出与锌指酶同类型的双链DNA剪刀，称之为TALEN( Transcript ion Activator-Like Effector Nuclease)〇 所述CRISPR/Cas9是2012年，Jinek等报道一种更为简单、高效和低成本的基因打 革巴工具--CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/ Cas9(CRISPR associated)革巴向基因改造（敲除、敲入）技术（Jinek M，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity·Science 2012，337(6096):816-21)〇 如果仅根据现有技术的方法将同源基因重组和基因打靶技术两种技术进行简单 组合，将无法实现本专利技术的目的。 这是因为，不仅两种技术的原理完全不同，而且，依据现有DNA修复的理论知识，即 使联合应用二者，也仅有可能实现插入某特定序列，并不能删除某特定序列。 本专利技术不是简单的将传统的同源重组与现代的基因打靶技术相结合，而是根据各 自的特征进行合理利用。首先TALEN或CRISPR/Cas9需要左右臂或gRNA序列与目的基因完全 结合才能发挥断裂双链DNA的效应，因此首先我们将TALEN的一条臂或CRISPR/Cas9的gRNA 设计在目标位点上（打靶位点在目标位点的上游或下游），将其转染进细胞后就不会对 donor DNA进行切割，当得到单等位基因编辑的目的细胞后，我们又将打靶位点设计在目标 位点，这样就避免TALEN或CRISPR/Cas9对已经编辑的一条链进行切割。此外在利用同源重 组的过程中，首先我们在打靶的同时转入含有经过修饰过的donor DNA，使断裂的DNA双链 在修复的时候能与之进行同源重组，并最终得到经过校正的DNA链。后来，在得到一条单等 位基因修饰的链后，进行第二轮打靶时，便不再使用donor DNA，因为已经修饰的一条链即 是同源重组的最好模板。 本专利技术人开创了一种基因组DNA序列精准编辑方法，按如下步骤进行： 1)构建一个两侧由相关基因同源序列组成、其中含有该基因预期突变内容的 donor DNA； 2)以预期突变位点附近本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因组DNA序列精准编辑方法，按如下步骤进行：1)构建一个两侧由同源序列组成的任意突变基因；2)以目标位点一侧为靶点设计相应的TALEN或CRISPR/Cas9；3)将该预先构造好的donor DNA与TELEN或CRISPR/Cas9同时转染到操作细胞内；导致该基因靶点处双链断开，并且随后部分断端会以donor DNA为模板进行修复；4)通过单细胞克隆培养与基因测序，筛选出单等位基因修饰的细胞株；当两个等位基因均发生了预期突变，基因组DNA序列精准编辑即告成功；所述donor DNA含突变内容和相关基因的同源序列；所述TALEN或CRISPR/Cas9是能够特异性地分别与靶点的两侧或单侧结合从而导致靶点处DAN双链断开的质粒；TALEN是一对质粒，CRISPR/Cas9是单质粒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李东升，丁妍，卢智勇，
申请(专利权)人：丹弥优生物技术湖北有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42