水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条及其制备方法技术

水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条及其制备方法，涉及毛皮动物病毒性传染病病原的检测技术领域。本发明专利技术的胶体金检测试纸条包括：样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜的检测线上喷涂VP2蛋白，所述NC膜的质控线上喷涂羊抗鼠二抗。本发明专利技术的水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条的制备方法，主要包括以下步骤：原核表达水貂细小病毒(MEV)VP2及VP1蛋白及其纯化；水貂细小病毒(MEV)单克隆抗体的制备；胶体金溶液的制备；金标抗体溶液的制备；金标垫的制备；NC膜的预处理；组装。本发明专利技术有助于毛皮动物养殖场净化水貂细小病毒性肠炎，方便基层兽医人员的操作。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及毛皮动物病毒性传染病病原的检测
，具体涉及一种水貂细小 病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条及其制备方法。
技术介绍
水紹肠炎病毒(Mink enteritis virus，MEV)引起的水紹病毒性肠炎发病率和死 亡率高，给养貂业带来了巨大的经济损失。然而本病没有特异的治疗方法，只能采用疫苗免 疫来预防，所以对水貂病毒性肠炎的诊断显得尤为重要。目前对MEV的诊断主要是HA-HI和 传统PCR方法，HA操作繁琐，耗时费力，而且需要准备猪的红血细胞;而PCR是近些年发展起 来的分子生物学诊断方法，主要用于病毒核酸的检测，但是PCR方法需要专业的仪器设备， 而且操作人员需要经过专门的培训才能在专门的实验室内操作。 自从1971年Faulk与Taylor创立胶体金标记技术以来，胶体金已成为继焚光标记、 酶标记和放射性免疫标记之后的又一种新型的免疫标记技术。胶体金技术具有方便快捷、 特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备和试剂、结果判断直观等优点，正因为这些特性使它 在工作量大、设施较简单的动物检验检疫实际工作中具有很大的实用性，满足了基层兽医 检测和大面动物检测需求，所以在兽医传染病上得到了广泛的应用，尤其是病毒性传染病， 目前已经在多种动物病毒的检测上应用了本技术。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供一种快速检测水貂肠炎病毒抗原的胶 体金试纸条及其制备方法。 本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下： 本专利技术的水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条，包括:样品垫、金标 垫、NC膜和吸收垫，所述NC膜的检测线上喷涂水貂细小病毒VP2蛋白，所述NC膜的质控线上 喷涂羊抗鼠二抗;所述金标垫的制备方法为:采用20nm胶体金溶液标记水貂细小病毒单克 隆抗体获得金标抗体溶液，将其按照6yl/cm的点样量喷涂于玻纤膜上获得金标垫;所述水 貂细小病毒单克隆抗体是采用水貂细小病毒VP1蛋白制备的，所述水貂细小病毒VP1蛋白的 氨基酸序列如序列表中的SEQ ID N0:2所示。 进一步的，所述水貂细小病毒VP2蛋白浓度为0.85mg/ml，所述羊抗鼠二抗浓度为 lmg/ml〇 本专利技术还提供了上述水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条的制备 方法，包括以下步骤： 步骤一、PCR扩增水貂细小病毒MEVB株VP2基因及VP1部分基因，定向克隆至原核表 达载体构建重组质粒，并转化至宿主菌BL21中，IPTG诱导后经纯化后得到水貂细小病毒VP2 蛋白和水貂细小病毒VP1蛋白；步骤二、利用纯化的水貂细小病毒VP1蛋白制备水貂细小病毒单克隆抗体；步骤三、采用柠檬酸还原法制备20nm胶体金溶液；步骤四、采用20nm胶体金溶液标记水貂细小病毒单克隆抗体获得金标抗体溶液； 步骤五、玻纤膜经预处理后，按照6yl/cm的点样量在玻纤膜上喷涂金标抗体溶液， 获得金标垫； 步骤六、将纯化后的浓度为0.85mg/ml的水貂细小病毒VP2蛋白喷涂在NC膜的检测 线上，将浓度为lmg/ml的羊抗鼠二抗喷涂在NC膜的质控线上； 步骤七、将NC膜、金标垫、样品垫和吸收垫组装成胶体金检测试纸条。 优选的，步骤一中，所述原核表达载体为PET-30a。 优选的，步骤一中，水貂细小病毒VP2蛋白和水貂细小病毒VP1蛋白的纯化方法为： 利用His标签进行纯化，经His Bind Purification Kit纯化试剂盒纯化即可得到目的蛋 白。 优选的，步骤二中，利用纯化的水貂细小病毒VP1蛋白制备水貂细小病毒单克隆抗 体的具体方法为： (1)将纯化的水貂细小病毒VP1蛋白免疫BABL/c小鼠，首次免疫将水貂细小病毒 VP1蛋白与弗氏完全佐剂等体积乳化后，采用腹腔注射方式免疫，每间隔两周进行一次免 疫，共免疫4次，其中第2次、第3次采用弗氏不完全佐剂乳化，第4次是融合前3天的加强免 疫； (2)加强免疫后经过间接ELI SA方法测定小鼠血清抗体效价，水貂细小病毒抗体效 价达到1〇5以上进行融合，无菌取小鼠脾脏，研磨离心后与骨髓瘤细胞SP2/0融合，采用间接 ELISA方法进行筛选以及有限稀释法进行亚克隆，最终筛选出分泌抗水貂细小病毒抗体的 杂交瘤细胞株14株，选取亲和力强的细胞株采用体内制备抗体的方法，制备水貂细小病毒 单克隆抗体。 优选的，步骤三中，采用柠檬酸还原法制备20nm胶体金溶液的具体方法为：取1 %的氯金酸溶液lmL加入去离子水99mL充分混匀后，加热至沸腾;边搅拌中边 加入1 %的柠檬酸三钠溶液1.5mL，混匀，并使其保持沸腾状态，溶液颜色则由浅黄色依次转 变为浅黑色、黑色、深紫色，最终稳定为酒红色，继续煮沸5min，待冷却后用去离子水补充至 1 OOmL，获得20nm胶体金溶液，4 °C避光保存。优选的，步骤四中，金标抗体溶液的具体制备方法为： (1)取20nm的胶体金溶液lmL，用0 . lmol/I^K2C03溶液调至最佳PH值8.0，搅拌混 匀； (2)加入纯化后的水貂细小病毒(MEV)单克隆抗体12yg，混匀，室温静置30min; (3)加入PEG-20000和BSA溶液搅拌混匀，静置30min; (4)将已经标记好的胶体金探针1500r/min离心30min，去除沉淀;上清12000r/min 离心30min，弃上清;将沉淀的胶体金探针用BSA和叠氮钠溶液悬浮并离心，最后将沉淀用 lmL的BSA和叠氮钠溶液的混合物进行溶解，获得金标抗体溶液，4°C避光保存。优选的，步骤五中，玻纤膜的预处理过程为： 将玻璃纤维素膜切割成5mmX 30cm的长条，用0.01mol/L、PH为8.2的TB溶液处理， 置于37 °C烘干。 优选的，步骤六中，采用Biodot XYZ3060仪器将纯化后的VP2蛋白及羊抗鼠二抗划 线于NC膜上;划线参数为:T线2yl/cm，C线1μ1/〇?，Τ线与C线间隔5mm;Biodot XYZ3060仪器 参数为:T线速度50mm/s，加速度1000mm/s2，Z轴下降55mm，drop为40nl，pitch 0.4,on time 0 · 4; C线速度50mm/s，加速度 1000mm/s2，Z轴下降55mm，drop为40nl，pitch 0 · 4，on time 0.4。 本专利技术的有益效果是： 本胶体金试纸条的建立将有助于毛皮动物养殖场净化水貂病毒性肠炎，方便基层 兽医人员的操作。 本专利技术不仅可以用于水貂病毒性肠炎的诊断，而且可以用于犬细小病毒病的诊 断，可以广泛的用于宠物医院等临床对犬细小病毒肠炎的诊断。 本专利技术用于快速检测水貂粪便中的细小病毒抗原，尤其适用于基层兽医及养殖场 技术人员的现场操作。【附图说明】 图1为本专利技术的水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条的实物图。图 中：S为加样孔，T为检测线，C为质控线。 图2为本专利技术的水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条结果判定示意 图。图2a为阳性判定结果(C线一条线），图2b为阴性判定结果(C线、T线两条线）。 图3为特异性试验结果图。图中：从左到右依次为CPV BJ14-24、MEVB、AMDV-G、CAV-2C和⑶V3以及水对照。图4为敏感性试验结果图。图当前第1页1 2&nb本文档来自技高网...

【技术保护点】
水貂细小病毒性肠炎病原体抗原胶体金检测试纸条，包括：样品垫、金标垫、NC膜和吸收垫，其特征在于，所述NC膜的检测线上喷涂水貂细小病毒VP2蛋白，所述NC膜的质控线上喷涂羊抗鼠二抗；所述金标垫的制备方法为：采用20nm胶体金溶液标记水貂细小病毒单克隆抗体获得金标抗体溶液，将其按照6μl/cm的点样量喷涂于玻纤膜上获得金标垫；所述水貂细小病毒单克隆抗体是采用水貂细小病毒VP1蛋白制备的，所述水貂细小病毒VP1蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王建科，程悦宁，张淼，程世鹏，林鹏，赵航，易立，仝明薇，曹智刚，孙亚茹，闫喜军，陈立志，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22