一种能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌及筛选方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌，名称为16#，分类名称为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为：CGMCC No.11898，保藏日期：2015年12月22日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本枯草芽孢杆菌能同时产果胶酶和半纤维素酶，几乎不产纤维素酶，将其应用于大麻脱胶，常温条件下脱胶96h左右，残胶率可以降低到13％左右，几乎到达纺织工业要求，该菌种还可以用于其他麻类脱胶中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于工业微生物
，尤其是一能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草 芽孢杆菌及筛选方法和应用。
技术介绍
大麻，为一年生的桑科，大麻属植物，高度约3米。学名为Cannabis satival，也称 为汉麻、寒麻、线麻、花麻等。大麻种植对气候和土壤的要求很低，而且在生长过程中无需农 药以及外界的施肥，抗虫害能力强，生长迅速，种植收获期短等，最重要的是大麻纤维具有 许多特有的优异性能，如抗静电、防过敏，良好的保温性、散热性，防菌、防腐、抗紫外等。大 麻纤维是重要的纺织纤维作物。 与其他麻类相比（苎麻，亚麻等），大麻纤维的生物脱胶研究相对较少，脱胶难度也 要高于其他麻类。其胶质含量高达40~50%，其中以多聚糖类为主;而且其纤维结构比较特 殊，单纤维长度差异较大，纤维分离性差等，这些原因都大大增加了大麻的脱胶难度。要使 大麻纤维具有可纺织性，必须除去大多数的胶质，使其单纤维相互分离变得柔软，这一过程 就称为脱胶。目前，麻纤维的脱胶在工业上多采用化学脱胶法，即采用强酸，强碱，表面活性 剂，螯合剂等在高温高压下对原麻进行处理。此种脱胶的方法虽然所用时间比较短，在几小 时之内就能得到精干麻，但是脱胶后的工业废水会给环境带来极大的污染;而且高温高压 下所需能耗高，给脱胶工业增大了成本;最重要的是，所使用的化学试剂严重损伤了纤维的 结构，降低了纤维的质量。随着环保意识的增强，此种方法已不再被人们所倡导。 为了克服这些缺点，改进工业上的脱胶工艺，近些年来国内外对麻纤维的微生物 脱胶或是用微生物所产的酶脱胶进行了广泛地研究，同时取得了不少研究成果。生物脱胶 作为一种新型的麻纤维的脱胶方法，其广阔的开发前景是显而易见的。生物脱胶主要是利 用微生物产生的果胶酶和半纤维素酶等分解胶质成分，但不损伤纤维结构；具有生产成本 低，反应条件温和，污染少，节水节能等优点。 目前，国内外对麻类的生物脱胶的研究多集中在苎麻，亚麻，红麻等生物脱胶方 面，而对大麻纤维的生物脱胶研究却相对较少，在以往的研究当中，大麻纤维处理周期过长 成为应用于生产实际的主要瓶颈。因此，寻找更为合适的脱胶菌株和脱胶条件，缩短脱胶处 理时间成为当务之急。 通过检索，发现如下一篇与本专利技术专利申请相关的专利公开文献： 大麻脱胶工业用酶制剂的制备方法及其应用（CN1374398)，酶制剂的制备方法包 括高酶活菌种的斜面培养和保存、摇瓶培养、种子罐培养和发酵罐生产，选用枯草芽孢杆菌 No. 13菌株，保藏号为CCTCC NO.M200038。大麻脱胶的方法包括发酵酶液过滤渣，稀释酶液3 ~6倍，放入脱胶罐中，将稀释酶液的pH调至7.5~9.0，原麻预处理，脱胶液与原麻浴比（10 ~20):1，脱胶时间2~10小时。本专利技术方法无污染，制成的大麻麻条平均长度、细度、断裂强 度，均好于化学法。 通过对比，本专利技术专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一株能同时生产果胶酶和半纤 维素酶的菌株，该菌株可以在温和的条件下应用于大麻纤维的生物脱胶中。 为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下： -种能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌，名称为16#，分类名称为:枯 草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为:CGMCC No. 11898,保藏日期：2015年12月22 日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心。 而且，步骤如下：⑴菌株的筛选和分离： 筛选来自处理生活垃圾的土壤中的菌株，并将其冻干成菌粉； ①富集培养:称取采集到并冻干的菌粉置于大麻富集液体培养基中，所述菌粉与 大麻富集液体培养基的比例g:mL为1:150，在37°C下，180~220r/min富集培养24小时； ②初筛：富集培养后的菌液按照10倍梯度稀释：用灭过菌的生理盐水将富集的菌 液稀释成…'…'…'…'…'…'，^不同稀释度的样品悬液屈荡混匀后分别吸取 10- 5、10-6、10-7的菌悬液200yL，涂布于果胶筛选固体培养基或木聚糖筛选固体培养基中，在 37°C下倒置培养24小时，通过刚果红显色，测量透明圈直径R和菌落直径r，以R/r的比值来 初步判断菌株的产酶能力； 然后挑取长势较好，R/r的比值较大的单菌落，点接到果胶筛选固体培养基或木聚 糖筛选固体培养基中，在37°C下倒置培养24小时，挑选R/r的比值较大的单菌落在LB固体培 养基中分尚纯化； 这样分离纯化后所得的细菌既能产果胶酶又能产木聚糖酶，然后把这些细菌保藏 于终质量浓度为15%的甘油管中，于-80°C冻存备用； ③复筛:先将初筛所保藏的细菌在LB固体培养基中活化，以一环的接种量接种到 装有50mL的液体LB的250mL的三角摇瓶的培养基中，37°C下摇瓶培养16~24小时作为种子 液，菌体浓度0D6QQ达到2~2.6; 称取4-10g原麻，先沸水浴处理20~30min后装入250mL的三角摇瓶中，接种5~ 10mL，以浴比1: 20~25加入含有0.2 %氮源的自来水，所述氮源为硫酸铵、硝酸铵、尿素、草 酸铵、碳酸铵中的一种或几种的混合物，在37°C下、180~220r/min脱胶10~12小时后取出， 检测残胶率，选取残胶率低的菌株作为脱胶菌，命名为16#;⑵菌株的鉴定：菌株的个体形态鉴定:对所筛得的脱胶细菌首先进行形态学鉴定，发现16#菌菌落 呈乳白色，菌落较大、粘稠、表面光滑不透明，边缘整齐，较老的菌体表面起褶皱;经过革兰 氏染色都显阳性，杆短小，且在菌体中央形成芽孢，初步断定为芽孢杆菌属； 16SrDNA基因序列测定和分析：以16#菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增16S rDNA并测序； 在NCBI上进行Blast分析表明：16#菌株的16S rDNA序列与枯草芽孢杆菌16S rDNA 序列的一致性高达99%，即得能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌。而且，所述步骤⑴①中大麻富集液体培养基为： 大麻粉末2.0g，硝酸铵0.2g，磷酸氢二钾0.05g，硫酸钠0.05g，蒸馏水100mL，pH 7.0〇 而且，所述步骤⑴②中果胶筛选固体培养基为:果胶0.5g，硝酸铵0.2g，磷酸氢二 钾0 · lg，硫酸钠0 · 05g，硫酸镁0 · 06g，琼脂粉2 · 0g，刚果红0 · 02g，蒸馏水100mL，pH 7 · 0~ 7.5;或者，所述步骤⑴②中木聚糖筛选固体培养基为：木聚糖l.Og，硝酸钾O.lg，硫酸镁 0.05g，氯化钠0.05g，磷酸氢二钾0.05g，刚果红0.02g，琼脂粉2.0g，蒸馏水100mL，pH 7.0~ 7.5。 而且，所述步骤⑴②中LB固体培养基为： 胰蛋白胨1 · 0g，酵母提取物0 · 5g，氯化钠1 · 0g，琼脂粉2 · 0g，蒸馏水100mL，pH 7 · 0。 而且，所述步骤⑴③中液体LB为； 胰蛋白胨l.〇g，酵母提取物〇.5g，氯化钠 l.Og，蒸馏水100mL，pH 7.0。 -种如上所述的能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌在大麻脱胶中的 应用。而且，以所述枯草芽孢杆菌为脱胶菌接种于液体种子培养基，置于37°C摇床中，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能同时产果胶酶和半纤维素酶的枯草芽孢杆菌，其特征在于：名称为16#，分类名称为：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，保藏编号为：CGMCC No.11898，保藏日期：2015年12月22日，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黎明，路福平，杨田，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12