本发明专利技术提供了一种双相体系促进微生物合成2-羟基-3-苯基丙酸的方法，包括如下步骤：配制水/有机溶剂双相体系；活化菌体细胞，收集菌体用缓冲液洗涤后，悬浮在上述的水/有机溶剂双相体系，并加入底物苯丙酮酸钠和葡萄糖，进行全细胞转化；最后提纯得到2-羟基-3-苯基丙酸。本发明专利技术的合成方法，通过配制形成水/有机双相体系增加底物的溶解度，生成的产物部分溶解于有机相中，减轻了底物和产物对生产菌株的抑制作用，从而提高产物的产量，在优化条件下，摇瓶中分批补加底物，PLA产量达到18.31g/L。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种2-羟基-3-苯基丙酸的合成方法，特别涉 及。
技术介绍
2-羟基-3-苯基丙酸(PLA)，是一种广泛存在于乳酸菌发酵产品和蜂蜜中的有机 酸。大量研究表明PLA可以有效抑制包括食源性致病细菌、酵母和霉菌等多种微生物的生 长。在饲料添加剂、医药、化妆品等多方面都具有广泛的应用前景。PLA对人和动物细胞均无 毒性，还具有抑菌谱广，有望作为一种理想的食品防腐剂而获得研究人员的广泛关注。 目前为止，主要应用真菌、乳酸菌、丙酸菌等微生物全细胞转化生产PLA。但是转化 过程中底物苯丙酮酸钠(PPA)在水中溶解度较低，而且对微生物的生长有一定的抑制作用， 生产得到的PLA的抑菌性也会对生产菌株具有抑制作用，底物与产物的双重抑制作用限制 了 PLA产量的提高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种水/有机双相体系及其合成2-羟基-3-苯基丙酸PLA的方法。 为实现上述目的，本专利技术所要解决的第一方面的技术问题是提供双相体系促进微 生物合成2-羟基-3-苯基丙酸的方法，包括如下步骤： (1)选择有机溶剂，配制水/有机溶剂双相体系； (2)活化菌体细胞，收集菌体用缓冲液洗涤后，悬浮在上述的水/有机溶剂双相体 系，并加入底物苯丙酮酸钠和葡萄糖，进行全细胞转化过程的优化； (3)在发酵罐中通过间歇补加底物于水/有机溶剂双相体系进行全细胞转化PLA。 本专利技术的一优选技术方案中，所述的菌体细胞选自大肠杆菌细胞、芽孢杆菌、乳酸 菌。 本专利技术的一优选技术方案中，步骤（1)中，所述有机溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、醇 类、不饱和脂肪酸、液态烷烃或其取代衍生物。 本专利技术的一优选技术方案中，步骤（1)中，所述有机溶剂选自环己烷、己烷、辛烷、 三氯甲烷、油酸、异戊醇。 本专利技术的一优选技术方案中，步骤(1)中，所述有机溶剂正辛烷。 本专利技术的一优选技术方案中，步骤（1)中，所述水/有机溶剂双相体系中，水相与有 机相的体积比为1.5-1:1。 本专利技术的一优选技术方案中，步骤(2)中，水/有机溶剂双相体系中含有磷酸盐缓 冲液;且优选pH为7.0。本专利技术的一优选技术方案中，步骤(2)中，所述转化过程的温度为30-45Γ。本专利技术的一优选技术方案中，步骤(2)中，所述转化过程中采用200rpm-350rpm转 速进行转化。 本专利技术的一优选技术方案中，在优选转化条件下，分批补加大肠杆菌菌体、底物苯 丙酮酸钠和葡萄糖生产PLA。 本专利技术的一优选技术方案中，所述的大肠杆菌细胞优选为E.coli BL21-pET-28a-D_LDHY52V;制备得到(R)_2_羟基_3_苯基丙酸。 本专利技术的方法中，转化体系中，菌体浓度为10g/L-40g/L，优选为20g/L;底物苯丙 酮酸钠浓度为1 〇g/L_25g/L，优选为15g/L。 本专利技术具有的优点和有益效果是：配制形成水/有机双相体系，底物的溶解度增 加，生成的产物部分溶解于有机相中，减轻了底物和产物对生产菌株的抑制作用，从而提高 产物的产量。 双相体系是形成水相与有机相的混合两相，在此体系下转化底物PPA生成PLA，PPA 与PLA在水相与有机相中的分配系数不同，选择PLA溶解度高，PPA溶解度低的有机溶剂，增 加 PPA的溶解度，同时使生产得到的PLA部分溶解于有机相中，减少由于PLA的抑菌作用造成 的对生产菌株的抑制，从而提高PLA的产量，发酵罐恒速流加底物生产PLA，测得PLA产量为 22.57 ±0.02g/L。在 5L 发酵罐中 PLA 产量达到 22.57g/L。【附图说明】图1为水相与正辛烷体积比对PLA产量的影响。图2为转化温度对PLA产量的影响线形图。图3为转速对PLA产量的影响柱形图。 图4为底物浓度对PLA产量的影响柱形图。 图5为菌体浓度对PLA产量的影响柱形图。 图6为最优条件分批补加底物生产PLA的曲线图。 图7为发酵罐生产PLA时间曲线图。【具体实施方式】： 为进一步理解本专利技术，下面结合具体实施例对本专利技术优选方案进行描述，但是应 当理解，这些描述只是为进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的限 制。 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明，实施例中采用的实施条件可以根 据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 实施例1:筛选有机溶剂 选用大肠杆菌，优选如重组大肠杆菌E.coli BL21(pET-28a-D-LDHY52V)(本实验 室构建(211116七&1.，2015))，具体见0呢01510279435.9公开的方法 ;按2%的接种量接种到 装有100mL的LB液体培养基(含50yg/mL卡那霉素）的摇瓶中，37°C，200rpm恒温震荡培养至 0D600 = 1.0左右时，加入IPTG至终浓度为lmmol/L，25°C诱导8h，4°C、6000rpm离心5min，收 集菌体用pH 7.0的磷酸钾缓冲液洗涤2次，收集离心得到的菌泥重悬于总体积为10mL，水相 与有机相等体积混合，配制双相体系(水/甲苯、水/乙酸乙酯、水/环己烷、水/油酸、水/正辛 烷、水/三氯甲烷、水/正己烷、水/异戊醇），菌体浓度0D600 = 12.23，加入200g/L底物0.5mL， 葡萄糖终浓度20(^/1，37°(：、200印111反应111，同时设置对照组即纯水相条件下反应生产?1^。 12000rpm离心2min分离上下两层，分别稀释适当倍数经0.22μπι滤膜过滤后进行高效液相检 测。色谱条件为:色谱柱为Shim-pack VP-ODS C18分析柱;流动相为A: 0.05 %三氟乙酸水溶 液，8:0.05%三氟乙酸甲醇溶液；流速1111171^11;0-201^11，8:10%-100% ;20-231^11，8: 100%;23-25min，B:100%-10%。柱温30°C;进样体积5yL;检测波长210nm。计算所得PLA的 产量为水相与有机相中的PLA的质量之和与体系总体积之比。比较对照组与实验组生成PLA的产量。根据结果显示在不同的有机相中，PPA与PLA 的分配系数不同，PLA在异戊醇、乙酸乙酯和正辛烷中的溶解度相对较高，而在水/正辛烷形 成的双相体系中，PLA的产量较其他双相体系高，因此选择正辛烷做双相体系的有机相，配 制水/正辛烷双相体系。实施例2优化转化过程转化过程中，温度、转速、底物浓度、水相与有机相的体积比、菌体量等因素都会影当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双相体系促进微生物合成2‑羟基‑3‑苯基丙酸的方法，包括如下步骤：(1)选择有机溶剂，配制水/有机溶剂双相体系；(2)活化菌体细胞，收集菌体用缓冲液洗涤后，悬浮在上述的水/有机溶剂双相体系，并加入底物苯丙酮酸钠和葡萄糖，进行全细胞转化；(3)在发酵罐中通过间歇补加底物于水/有机溶剂双相体系进行全细胞转化PLA。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱益波，郑青云，孙亚男，徐艳，王立梅，齐斌，
申请(专利权)人：常熟理工学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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