DNA中有无变异的判别方法技术

本发明专利技术提供一种判别DNA中有无变异的新方法。一种判别有无具有多个变异型的DNA的变异的方法，包括如下工序：在能够与DNA结合的1组引物对、不与具有变异的DNA结合而能够与不具有变异的DNA结合并被第1荧光物质标记的第1探针、以及能够与具有变异的DNA和不具有变异的DNA这两者结合并被放射与第1荧光物质不同的荧光波长的光的第2荧光物质标记的第2探针存在的条件下，进行用于扩增DNA的热循环。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及DNA中有无变异的判别方法。
技术介绍
近年来，从患者中分离出对大环内酯系药剂显示抗药性的耐药型肺炎支原体菌 (Mycoplasma pneumoniae)〇 为了使用以PCR(Polymerase Chain Reaction :聚合酶链反应）法为代表的基因 检测法来判别支原体菌是否为耐药型，能够通过调查肺炎支原体菌的核糖体内rRNA遗传 子域V区域的第2063号和第2064号的变异（正常型为A2063A和A2064A，高度耐药型为 A2063G、A2063C、A2064G或者A2064C，中度耐药型为A2063T)(非专利文献1、2)。并且，已 知正常型与高度和中度耐药型以1 :9的比例存在，且肺炎支原体菌多半为耐药型。 另一方面，迄今为止，耐药菌等的变异体的解析是通过测序法、PCR-RFLP法、实时 PCR法等进行的。 专利文献 专利文献1 :日本特开2014-42459号 非专利文献 非专利文献1 :平成24年度罕见感染症诊断技术研讨会资料，平成25年2月27日 (周三），支原体感染症国立感染症研究所，细菌第二部，见理刚 非专利文献 2 :Antimicrobial Agents and Chemotherapy ρ· 1108-1109,An tibiotic Sensitivity of 40 Mycoplasma pneumoniae Isolates and Molecul ar Analysis of Macro1ide-Resistant Isolates from Beijing, China,Fei Zhao, Min Lv, Xiaoxia Tao, Hui Huang, Binghua Zhang, Zhen Zhang, and Jianzhong Zhang
技术实现思路
但是，通过以往的测序法等进行耐药菌判别的情况下，有实验繁琐且耗费时间的 课题。 本专利技术是为了解决上述课题中的至少一部分而作出的，可通过以下方式实现。 本专利技术的一个实施方式为一种方法，其判别有无具有多个变异型的DNA的变异， 该方法包括如下工序：在能够与DNA结合的1组引物对、不与具有变异的DNA结合而能够与 不具有变异的DNA结合且被第1荧光物质标记的第1探针、以及能够与具有变异的DNA和 不具有变异的 DNA这两者结合且被放射与第1荧光物质不同的荧光波长的光的第2荧光物 质标记的第2探针存在的条件下，进行用于扩增DNA的热循环。另外，第1探针结合的DNA 链中的碱基序列的位置和第2探针结合的DNA的链中的碱基序列的位置被1组引物对结合 的DNA的链中的碱基序列的位置所夹持。第1探针结合的DNA链可以是第2探针结合的 DNA的互补链。第1探针可以为TaqMan探针，第2探针可以为TaqMan探针。另外，扩增工 序是使用核酸扩增反应装置进行的，核酸扩增反应装置包括：安装部，能够安装填充有核酸 扩增反应液和与上述核酸扩增反应液相比比重小且不与上述核酸扩增反应液混和的液体 的核酸扩增反应容器；第1加热部，对上述核酸扩增反应容器的第1区域进行加热；第2加 热部，对上述核酸扩增反应容器的第2区域进行加热；驱动机构，对第1配置和第2配置进 行切换，所述第1配置为上述第1区域沿重力作用的方向位于上述第2区域的下方，所述第 2配置为上述第2区域沿重力作用的方向位于上述第1区域的下方。DNA可以是来自肺炎 支原体的DNA。 根据本专利技术，能够提供一种判别DNA有无变异的新方法。【附图说明】 图1是本专利技术的一个实施方式涉及的核酸扩增反应容器的截面图。g表示重力方 向。 图2是本专利技术的一个实施方式涉及的升降式PCR装置的立体图。（A)表示关闭盖 的状态，（B)表示打开盖的状态。 图3是本专利技术的一个实施方式涉及的升降式PCR装置中的主体的分解立体图。 图4是示意地表示本专利技术的一个实施方式涉及的升降式PCR装置中的主体的沿图 2㈧的A-A线的截面的截面图。㈧表示第1配置，（B)表示第2配置。 图5是表示本专利技术的一个实施方式涉及的正常型探针、有无探针及引物对的配置 的图。 图6是表示本专利技术的一个实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。 图7是表示本专利技术的一个实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。 图8是表示本专利技术的一个实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。 图9是表示本专利技术的一个实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。 图10是表示本专利技术的一个实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。 图11是表示本专利技术的一个实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。 图12是表示本专利技术的另一实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。 图13是表示本专利技术的还一实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。 图14是表示本专利技术的还一实施方式涉及的使用正常型探针和有无探针得到的正 常菌和耐药菌的判别结果的图。【具体实施方式】 本专利技术的目的、特征、优点及其思想根据本说明书的记载对本领域技术人员而言 是明确的，基于本说明书的记载，只要是本领域技术人员，就能容易地再现本专利技术。以下记 载的专利技术的实施方式和具体实施例等表示本专利技术的优选实施方式，是为了例示或说明而示 出的，本专利技术不限定于这些。在本说明书中公开的本专利技术的意图和范围内，基于本说明书的 记载，可以进行各种改变和修饰，这对本领域技术人员而言是明确的。 (1) DNA有无变异的判别方法 本专利技术的判别方法是判别在DNA中有无具有多个变异型的变异的方法，其特征在 于，使用与不具有变异的DNA结合而与具有变异的DNA不结合的TaqMan探针来判别有无变 异。 以下，以来自肺炎支原体菌的DNA为例，说明本专利技术的判别方法的一个实施方式。 使用能够与来自不具有耐药性变异的肺炎支原体菌（以下，称为正常菌）的DNA结合而不 能与来自具有耐药性变异的肺炎支原体菌（以下，称为耐药菌）的DNA结合的TaqMan探针、 以及能够与双方的DNA结合的TaqMan探针来判别正常菌和耐药菌。 将成为耐药菌所具有的耐药性的原因的变异汇总在表中，如下所述。 表 1 以往，为了判别正常菌和耐药菌而调查正常菌和耐药菌两者的DNA的碱基序列， 然而，本专利技术通过使用与正常菌的DNA结合而不与耐药菌的DNA结合的TaqMan探针、以及 与正常菌和耐药菌这两者的DNA结合的TaqMan探针来进行PCR，从而与以往的方法相比能 够更简便地判别正常菌和耐药菌。 具体而言，如图5所示，使用在上述第2063号和第2064号的碱基均为A的情况下 结合且被第1荧光物质标记的TaqMan探针（称为正常型探针）、以及与正常菌和耐药菌具 有相同的碱基序列的DNA部分结合且被放射与第1荧光物质不同的荧光波长的第2荧光 物质标记的TaqMan探针（称为有无探针，在夹持这些探针的位置，配置1组引物对，进行 TaqMan PCR〇 对于正常菌的DNA，正常型探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种判别有无具有多个变异型的DNA的变异的方法，包括如下工序：在能够与所述DNA结合的1组引物对、第1探针、以及第2探针存在的条件下，进行用于扩增DNA的热循环；所述第1探针不与具有变异的所述DNA结合，而能够与不具有变异的所述DNA结合，并被第1荧光物质标记，所述第2探针能够与具有所述变异的DNA和不具有所述变异的DNA这两者结合，并被放射与第1荧光物质不同的荧光波长的光的第2荧光物质标记。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：上原雅行，井手上公太郎，
申请(专利权)人：精工爱普生株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP