一种在门的分类层面上测定菌群组成的方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域中的菌群检测方法，尤其是基于门特异性引物测定菌群组成结构的定量方法。该方法包括门特异性引物的设计过程；qPCR体系的配置；qPCR条件的设定与运行等步骤。基于门特异性引物的定量扩增可以在门的层面上快速考察样本中菌群的宏观结构及其在不同样本中的差异。本发明专利技术是针对各个门的核糖体基因的总拷贝数的定量方法，而非各个门包括的各个物种细胞的详细个数。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中的菌群操纵方法，尤其是基于门特异性引物测定菌群 组成结构的快速qPCR定量方法。
技术介绍
天然复杂菌群一般由几十、几百甚至更多不同种微生物组成，而且该组成在不同 的环境条件下会发生动态变化。几乎所有的天然菌群所包括的菌种的大部分人类都了解甚 少，菌群样本中经常会有一半以上的菌种属于未知菌且尚不知如何培养，所以对天然菌群 进行快速的结构组成定量测定还比较困难。 国内外目前常见的几种菌群结构测定技术综述如下：（1)传统培养方法;比如土壤 中大部分微生物属于未培养菌，使用传统培养基培养土壤微生物速度慢，鉴定工作量很大； (2)焦磷酸高通量测序方法;这是目前国内外流行的一种群落结构定量测定方法，一般通过 生物技术公司委托服务来完成，价格昂贵，可以返回的测序个数高达几十万条，一般可以定 性定量到属；（3)FISH技术；（4)DGGE/TGGE技术；（5)T-RFLP技术；（6)RAPD技术；（7) SSCP技 术；（8)AFLP技术等。 上述所有技术都很难做到现场快速(2小时左右)测定菌群的组成结构。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种基于门特异性引物的实时定 量聚合酶链式反应扩增的优化方法。扩增靶序列是核糖体基因序列。虽然本专利技术提供的引 物特异性非常高，但是核糖体基因在各个门所包括的各个菌种基因组中的拷贝数并非全都 清楚，计算的是某个门包括的全部物种的核糖体基因的总拷贝数，所以，本专利技术是针对各个 门的核糖体基因的总拷贝数的定量方法，而非各个门包括的各个物种细胞的详细个数。该 方法通过在PCR反应体系中使用门特异性引物达到任意样本中对具体某个门的微生物菌群 的特异扩增，并使用qPCR进行扩增。由于国内外的qPCR技术从样本处理到定量结果出来已 经可以控制在2小时以内，引物设计并验证后，实际应用起来将具备定量识别效果显著、过 程快捷、成本低廉的效果。 本专利技术是通过以下技术方案来实现的： 该基于门特异性引物的核酸聚合酶链式反应扩增的优化方法，该方法包括以下步 骤： 门特异性引物的设计:通过样本中核糖体基因的扩增（比如16S rDNA扩增引物可 以为27F(5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'）和1492R(5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACTT-3'））及ΤΑ克隆测序，获得一批有效克隆，通过菌落克隆测序，生物信息学序列分析，得到各 个克隆对应的物种信息(界门纲目科属种）。通过对全部有效测序克隆中的核糖体基因序列 的多序列比对和反复比较，找出来各自门的若干个特征性SNP(单核苷酸多态性)位点。该位 点作为引物的3'最末端位置使用。引物的3'倒数第二位的碱基设计原则是，它与靶序列之 间没有错配或形成一个错配(弱错配:A-C，T-G;或者是中等强度的错配:六4，(：-(：?)，与 非靶序列也形成一个错配(强错配:T-T，T-C，A-G;或者是中等强度的错配:A-A，C-C，G-G)。 这样一来，引物与靶序列完全配对或只有一个3'倒数第二位的错配，一般不影响扩增效果， 而与非靶序列有两个3'最末端的连续两个错配，一般导致扩增失败。如此可以获得单碱基 识别的门特异性引物。设计的扩增长度一般在80-500碱基以便于用于qPCR。这些引物对以 每个门的实际核糖体基因序列的TA克隆纯质粒为模板进行PCR扩增(使用NPK02试剂盒，山 东大正GREDBIO)验证及混合模板验证，以及qPCR(使用NPK62试剂盒，山东大正GREDBIO)验 证(要求只扩增出来特异目的条带，Tm值分析只有主带(不含引物二聚体或很少二聚体））， 确定各对引物的特异性。每个门选出最佳扩增特异性的引物各1对，但是最佳引物也可能有 好几对。上述设计方法不限于特定的哪个门，可以适用于任意（天然或人工）菌群样本中任 何门的特异性引物设计。设计的门特异性引物首先适用于所用样本。如果某个样本中某个 门的物种覆盖面足够大，比如包括了国内外该门已知物种的95%以上，则设计的门特异性 引物就具备95%的通用性，将还可以适用于很多其他样本。样本核糖体基因序列信息的获 得不必局限于TA克隆测序法。 通过上述特定的优化过程得到门特异性引物序列，之后通过有关生物技术公司进 行合成制备； qPCR体系的配置:可以使用任何qPCR试剂盒及qPCR仪器。qPCR仪器要求可以检测 对应试剂盒包含的焚光物质，如EvaGreen，SYBR green等； qPCR条件的设定与运行;依据不同菌群和不同的门进行扩增条件的调整优化;定 量识别同一个群落的不同的门时设计的引物尽量具备相近的Tm值，以便在相同的扩增条件 进行测试； qPCR产物检测：通过琼脂糖凝胶电泳即可检测。扩增条件优化后实际进行测定时 无需每次再进行产物的检测;qPCR产物的Tm值分析也可以作为扩增质量的判据;扩增产物 均一时Tm值分析可以看到单一产物峰； 本专利技术的优点和有益效果是： 1.天然菌群样本中相当一部分或大多数菌往往为未知微生物，直接在种等分类层 面上定量识别一批菌种还比较困难，而基于门特异性引物的定量扩增可以在门的层面上快 速考察样本菌群的宏观结构及其在不同条件下的结构变化，既简单又实用。 2.由于本方法可以在2小时左右现场完成测定，可以用来积累目标样本中菌群结 构定量数据与其生物学功能表现之间的关系数据。如果使用最先进的小型便携qPCR仪器， 从样本处理到最后完成定量所需要的时间还可以更短。 3.本专利技术的实施所涉及的耗材都是常见的分子生物学试剂，方便易得。所述的 qPCR体系配置可以使用任何常见的试剂盒。以山东大正（GREDBIO)的NPK62试剂盒为例， qPCR体系的组成见表格1. 4.与已有方法相比，本专利技术可以定量样本菌群的主要门的含量，且成本低廉。 表格1NPK62试剂盒(GREDBIO)qPCR体系组成 【具体实施方式】本专利技术通过以下实施例进一步详述，但不局限于下述实施例。具体操作方法如下： 实施例1门特异性引物的设计： 通过某土壤样本中16S rDNA的扩增（扩增引物为27F(5'-AGA GTT TGATCC TGG CTC AG-3'）和1492R(5'-GGT TAC CTT GTTACGACTT-3'），扩增模板为某土壤样本样品及ΤΑ 克隆测序，获得近800个有效克隆，除了未知菌类占60.78%，已知菌类（318个）分别属于 Bacteroidetes(3 · 79%)、Firmicutes(31·16%)、Proteobacteria(3·55 %)、 Synergistetes(0 · 63% )、Actinobacteria的Atopobium(0 · 13% )。通过对这318个16S序列 的多序列比对和反复比较，找出来找出来各自门的若干个特征性SNP(单核苷酸多态性)位 点共200多个。以这些SNP位点作为引物的3'最末端位置尝试设计引物。引物的3'倒数第二 位的碱基设计原则是，它与靶序列之间形成一个错配，与非靶序列也形成一个错配。这样一 来，引物与靶序列只有一个3'倒数第二位的错配，而与非靶序列有两个3'最末端的连续两 个错配。扩增长度在100-300碱基以便本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于门特异性引物测定菌群组成结构的定量方法，该方法包括以下步骤：⑴.门特异性引物的设计；⑵.qPCR体系的配置；⑶.qPCR条件的设定与运行；其特征在于：所述的qPCR体系中使用的引物为步骤(1)设计的门特异性引物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张治洲，罗锡梅，张会敏，高志磊，夏薇，王晋，何宏魁，李安军，周庆伍，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学威海，
类型：发明
国别省市：山东;37