本发明专利技术涉及一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的引物、试剂盒及方法，属于分子生物学领域。本发明专利技术的引物包括上游引物mecA-f和下游引物mecA-r，上游引物mecA-f的核苷酸序列为：5’-AATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGC-(THF)-GTTATATTTCTA-biotin-3’；下游引物mecA-r的核苷酸序列为：5’-TTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGAAATA-(THF)-TTAGTTCTTTA-biotin-3’；本发明专利技术采用重组酶聚合酶扩增法检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。采用本发明专利技术的引物检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌特异性强、扩增效率高，可有效、快速地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，属 于分子生物学领域。
技术介绍
金黄色葡萄球菌(Staphalococcus aureus)属革兰阳性球菌，微球菌科，葡萄球菌 属。它能引起化脓性炎症，当细菌侵入血液时，可引起致病性败血症。 自从上世纪40年代青霉素问世后，金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的 控制，但随着青霉素的广泛使用，有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶，能水解内酰胺环， 表现为对青霉素的耐药。为此科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲 氧西林(methici 11 in)。1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感 染，但随后1961年就发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)，MRSA从发现至今感染几乎 遍及全球，已成为院内和社区感染的重要病原菌之一。 自从1961年英国发现MRSA后，在欧美及亚洲一些国家相继报道了MRSA所致的院内 感染。从60年代后期到80年代，MRSA感染率大大增加。美国NNIS报道1975年182所医院MRSA 占金黄色葡萄球菌感染总数的2.4%，1991年上升至24.8%，其中尤以500张床以上的教学 医院和中心医院为多，因为这些医院里MRSA感染的机会较多，耐药菌株既可由感染病人带 入医院，也可因滥用抗生素在医院内产生。欧洲1993年1417家医院ICU分离的MRSA达60%。 而日本Kansai医科大学附属医院MRSA的分离率1993年达到41 %。国内在70年代发现有 MRSA，近几年MRSA的检出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黄色葡萄球菌中MRSA只占 5%，1988年上升至24%，1996年激增至72% JRSA感染多发生于免疫缺陷者，大面积烧伤， 大手术后患者，长期住院及老年患者，MRSA极易导致感染的流行和暴发。为有效控制MRSA的 感染，以及降低疾病造成的危害，建立准确、快速的检测方法是首要任务。 目前临床上检测MRSA常用的方法有细菌培养法和PCR法。其中，细菌培养法是检测 MRSA的金标准，但该方法需要进行药敏实验，通常需要3-5天才能看到最终的检测结果，检 测成本高、检测周期长;利用PCR方法可在短时间内使特定的核酸序列拷贝数几何级数增 加，有很高的灵敏度和特异性，但缺点需要专业的检测设备，难以在基层地区推广。由此可 见，MRSA感染的临床诊断，急需更简洁、灵敏的检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种扩增效率高、特异性强的 用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的引物。 同时，本专利技术还提供了一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒及方 法。 为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为:一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球 菌检测的引物，其包括上游引物mecA-f和下游引物mecA-r，上游引物mecA-f的核苷酸序列 为：5 ' -AATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGC-(THF)-GTTATATTTCTA-biotin-3 ' ；下游引物mecA-r 的核苷酸序列为：5'-TTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGAAATA-(THF)-TTAGTTCTTTA-biotin-3' ； 其中，THF为四氢呋喃，biotin为生物素。 上述上游引物mecA-f和下游引物mecA-r，其3 '端羟基均被生物素封闭掉。此处，任 意可以与探针3'羟基共价结合的基团均能起到封闭效果，故此处封闭3'端的羟基不限于生 物素。另，对于上游引物mecA-f而言，其中THF取代的是常规上游引物(常规上游引物的序列 为：5 ' -AATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGCTGTTATATTTCTA-biotin-3 '）中的 "T"。 本专利技术的引物是专利技术人对比大量MRSA(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)和MSSA(甲氧 西林非耐药金黄色葡萄球菌)菌株的基因序列，挑选MRSA特有的基因 mecA作为检测靶点，并 针对该靶点设计、合成上下游引物所得到的。针对mecA检测靶点，专利技术人设计合成了多条引 物，但实验表明，本专利技术的引物特异性强、扩增效率高，可有效、快速地检测耐甲氧西林金黄 色葡萄球菌。 由于本专利技术引物的3'端被封闭掉，故需先用核酸内切酶切开THF位点，形成自由的 3'末端，才能开始扩增反应。由此，也提高了扩增反应的特异性和严谨性。 作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的引物的优选实施方式，所 述上游引物mecA-f或下游引物的核苷酸序列中，有10个以下碱基的取代、添加或缺失。 作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的引物的优选实施方式，所 述上游引物mecA-f和下游引物mecA-r中，至少一条引物上标记有报告基团。作为本专利技术所 述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的引物的更优选实施方式，所述报告基团为荧光基 团。采用报告基团标记引物，可为后续检测提供方便。 另外，本专利技术还提供了一种含有如上所述引物的用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 检测的试剂盒。 作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的优选实施方式， 所述试剂盒还包括重组酶、聚合酶、DNA结合蛋白、缓冲溶液和核酸内切酶。 作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的更优选实施方 式，所述重组酶为T4uvsX/uvsY，所述聚合酶为Bsu DNA聚合酶，所述DNA结合蛋白为T4gp32; 所述缓冲溶液含有下述组分:Tr i s、乙酸钾、乙酸镁、二硫苏糖醇、Carbowax20M、dNTPs、ATP、 磷酸肌酸、肌酸激酶和逆转录酶;所述核酸内切酶为大肠杆菌核酸内切酶IV。进一步地，所 述缓冲溶液含有下述组分：50mmo/L Tris-HCl缓冲液、100mmo/L乙酸钾、14mmo/L乙酸镁、 2mmo/L二硫苏糖醇、5 % Carbowax20M、200ymo/L dNTPs、3mmo/L ATP、50mmo/L磷酸肌酸、 lOOng/L肌酸激酶和lOOng/L逆转录酶;其中，Tris-HCl缓冲液的pH值为7.9。所述uvsX/uvsY 为在反应体系中相互转换动态平衡的两种酶。 作为本专利技术所述用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的试剂盒的优选实施方式， 所述试剂盒还包括ddH20。 最后，本专利技术还提供了一种采用上述试剂盒检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的方 法，所述方法为重组酶聚合酶扩增法，其包括以下步骤： (1)提取样本 RNA; (2)配置反应体系：混合样本RNA、上游引物mecA-f、下游引物mecA-r、重组酶、聚合 酶、DNA结合蛋白、缓冲溶液和ddH20,得到反应体系； (3)震荡混匀步骤(2)制得的反应体系后，加入核酸内切酶，再次震荡混合均匀，于 37~42 °C下恒温反应，进行RPA扩增； (4)检测RPA扩增后的产物。重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplif ication，RPA)，是一种新型 的核酸扩增检测技术。与常规的PCR扩增（必须经过变性、退火、延伸三个步骤)相比，RPA反 应只需要在37~42°C恒温反应30分钟左右，即能够将痕量的核酸模板扩增10 12倍，达到可以 检出的水平，且RPA扩增不需要温控设本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测的引物，其特征在于：所述引物包括上游引物mecA‑f和下游引物mecA‑r，上游引物mecA‑f的核苷酸序列为：5’‑AATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGC‑(THF)‑GTTATATTTCTA‑biotin‑3’；下游引物mecA‑r的核苷酸序列为：5’‑TTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGAAATA‑(THF)‑TTAGTTCTTTA‑biotin‑3’。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：方国伟，洪冉，
申请(专利权)人：苏州达麦迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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