本发明专利技术公开了一种WT p53衍生物。本发明专利技术还公开了上述WT p53衍生物的制备方法和应用，所述衍生物为在相对于序列WT p53和SAH-p53-8第i和i+7的位置上的氨基酸使用常用天然半胱氨酸来替换母体肽链上相应的氨基酸残基，然后通过硫醚订合形成大环桥来稳定母体多肽的α-螺旋结构。所述衍生物在抗肿瘤方面具有应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及WT ρ53，同时还涉及其在生物学 上对肿瘤的治疗作用。
技术介绍
现代医学认为肿瘤是一种基因疾病。ρ53是一种非常重要的人类肿瘤抑制基因，它 具有DNA修复、细胞周期阻滞、凋亡的功能。由其表达产生的ρ53蛋白是一种肿瘤抑制功能的 执行者。MDM2是1987年发现的致癌基因。MDM2的表达产物是一种重要的ρ53负性调节蛋白。 癌基因 MDM2及其表达产物可与ρ53蛋白结合，同时抑制ρ53的正常生物学功能，从而可导致 肿瘤的发生和发展。 ρ53肿瘤蛋白是一个多功能蛋白。在不同形态(如低氧、热休克、DNA损伤等）的肿瘤 诱导下，Ρ53抑癌蛋白被激活，直接或间接地通过其他转录因子阻止细胞生长，诱导细胞凋 亡。一旦Ρ53失活或缺失，肿瘤就得到发生发展。癌基因 MDM2在很多肿瘤中表现出扩增，如： 13 %食道癌、10 %高分化神经胶质瘤和20 %软组织肉瘤中都有MDM2的扩增。 Kussie等人于1996年报道了P53-MDM2复合物的晶体结构。晶体结构表明ρ53和 MDM2蛋白的结合界面面积为14.98nm2，疏水作用是两者之间主要的结合力。晶体结构同时 表明P53蛋白的N端反式激活区域与MDM2蛋白的p53结合区相互作用，形成p53-MDM2复合物。 P53的N端17-27位的11个氨基酸形成的α螺旋复合物可紧密地嵌合到MDM2的N端103个(25-127位)氨基酸形成的疏水裂隙中，二者之间主要靠疏水作用结合。 Verdine等人于2007年将多肽WT ρ53(17-29位)作为模板，利用侧链带有末端烯烃 的非天然氨基酸替换母体WT ρ53肽链上相应的氨基酸残基，然后通过Grubbs催化剂关环 "钉合"成具有生物活性的α-螺旋多肽。通过一系列优化实验最终找到抑制癌细胞效果最好 的构象锁定多肽 SAH-p53-8(EC50 = 8.8yM)。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是针对WT p53在体内稳定性差、与靶蛋白结合能力有限和细胞 透过性差等方面的缺陷，设计了一系列新的WT p53衍生物。本专利技术的另一个目的是提供该 WT p53衍生物的制备方法。 WT p53序列：Ac-LSQETFSDLWKLLPEN-NH2 SAH-p53_8 序列： 专利技术人认为，鉴于P53重要的药学应用价值，有必要选择具有生物活性的多肽WT p53和SAH-p53-8作为模板，使用价格便宜且易得的Cys来替换母体肽链上i/i+7位置上的氨 基酸，然后通过肽链上两个半胱氨酸侧链的巯基与连接臂环合形成硫醚桥，来稳定母体多 肽的α-螺旋构象，并研究其在提高α-螺旋度、靶蛋白结合能力、细胞穿膜性等方面的性质， 从而建立一种新型的、简单高效的稳定合成多肽α_螺旋构象的化学修饰方法，由此完成了 本专利技术。 专利技术人选取WT ρ53和SAH-p53-8作为模板，保持作用位点氨基酸不变，使用便宜易 得的半胱氨酸替换母体肽链上相应位置的氨基酸残基，得到如下多肽化合物： 其中，131/134是在WT ρ53这个序列上用Cys和D-Cys替换了i/i+7(i = 4)位置上的 氨基酸得到的;004是在SAH-p53-8这个序列上用Cys替换了 i/i+7(i = 7)位置上的氨基酸得 到的。 在以上序列的基础上，对替换后的半胱氨酸通过连接臂（linker)成环，得到如下9 个多肽化合物： 所述连接臂（linker)见下表：本专利技术还公开了所述FT P53衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途。另外，本专利技术还 公开了一种药物，以所述WT p53衍生物为活性成分，用于治疗肿瘤。【附图说明】图1是多肽细胞穿膜性实验的荧光照片。【具体实施方式】试剂名称缩写： DMF:N，N-二甲基甲酰胺 DCM:二氯甲烷 NMP:N-甲基吡咯烷酮 DIC:N，N_二异丙基碳二亚胺 TFA:三氟乙酸 DIPEA:N，N-二异丙基乙胺 NMM:N-甲基吗啉 HOBt: 1-羟基苯并三唑 H0At:N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑 HOOBt: 3-羟基-1，2，3-苯并三嗪-4 (3H)-酮 Cl-H0Bt:6_氯-1-羟基苯并三氮唑 HBTU:苯并三氮唑-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯 HATU:2-(7偶氮苯并三氮唑)-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯 PyBOP:六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷 PyAOP: (3H-1，2，3-三唑并吡啶-3-氧基)三-1 -吡咯烷基磷六氟磷酸盐 PPTS:对甲苯磺酸吡啶盐 DMP:2,2_二甲氧基丙烷 EDT:1，2-乙二硫醇 PIP:哌啶 TIS:三异丙基硅烷本专利技术中WT p53衍生物改造肽的制备方法采用通常的Fmoc固相合成法合成。 实施例1: 原料及试剂:接肽树脂为Rink Amide树脂。 氨基酸衍生物为：Fmoc-Leu-〇H，Fmoc-Ser(tBu)-〇H，Fmoc-Gln(T;rt)-〇H，Fmoc-Cys (Trt)-〇H，Fmoc-Thr(tBu)-〇H，Fmoc-Phe-〇H，Fmoc-Asp(OtBu)-〇H，Fmoc-Trp(Boc)-〇H， Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Glu(OtBu)-〇H，Fmoc-Asn(Trt)-〇H; (1)制备 H-Asn(Trt)-树脂 称取2g取代度为0.7mmol/g的Rink Amide树脂于固相反应器中，加入DCM溶胀 20min，随后加入20 % PIP/DMF溶液反应20min脱除Fmoc保护基，分别用DCM、Me0H与DMF洗涤 多次，抽干。向固相反应器中加入Fmoc-Asn(Trt)-〇H(4mmol)、H0Bt(0 ·648g，4· 8mmol)、DIC (0.7!1^，4.8111111〇1)、01^(1011^)，20°(：反应20分钟。将树脂洗涤抽干，即得?111〇(3-4811(1'竹）-树 月旨，测得树脂替代度为〇 · 46mmo 1 /g。向树脂中加入封闭试剂8mL (醋酸酐（mmo 1): DI PEA (mmo 1) = 1:1)，反应2.5h，封闭剩余的氨基，分别用DCM、MeOH与DMF洗涤多次，抽干。用20 % PIP/DMF溶液脱除Fmoc保护基5min+15min，分别用DMF、DCM与MeOH洗涤多次，抽干，得H-Asn (Trt)_树脂。 (2)制备131树脂肽 取H-Asn(Trt)-树脂（2g)于固相反应器中，加入Fmoc-Glu(0tBu)-OH(2.76mmol)、 !108以0.4488,3.312111111〇1)、01(：(0.511^，3.312111111〇1)、01^(1011^)，30°(：反应211。偶联完成度可 以使用Kaiser测试检测；检测通过后，用20%PIP/DMF溶液脱除Fmoc保护基5min+15min，分 别用DCM、DMF与MeOH洗涤多次，抽干。 以此方法偶联剩余的氨基酸，在偶联过程中，偶联溶剂选自DCM、DMF和匪P中的任 意一个或一个以上的组合;偶联体系选自HOBt、H0At、H00Bt和Cl-HOBt中的任意一个或多个 与DIC的组合，或选自H0Bt、H0At、H00Bt和Cl-H0Bt中的任意一个或多个、DIPEA或NMM中的任本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种WT p53衍生物，其多肽序列如下：
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：苏贤斌，马晓娟，郭伦迪，刘李，汤同洋，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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