一种茶树miRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种茶树miRNA及其应用，该茶树miRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术通过Solexa高通量测序技术、生物信息学分析、RT-PCR等技术，首次从茶树浙农139品种中鉴定了miR32及其前体，该前体的碱基序列如SEQ ID NO.2所示。通过5'RLM-race、烟草瞬时表达、实时荧光定量PCR等技术，证明miR32可以负调控茶树GS1；1基因表达。通过GS1；1在拟南芥中过表达验证其在茶树氮素代谢中的重要作用，表明miR32参与调控茶树氮素代谢，提高茶树氮肥利用效率，改善茶叶品质如提高茶氨酸含量等方面具有潜在应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物学
，尤其涉及。
技术介绍
茶是世界三大饮料作物之一，富含丰富的代谢产物，对人体健康有重要作用。这些 代谢产物受植物体内氮素代谢的影响。氮代谢是植物体内重要的物质和能量代谢过程，其 中谷氨酰胺合成酶(GS;EC 6.3.1.2)是氮素代谢中的关键酶，其在ATP的供能下，催化NH4+合 成谷氨酰胺，然后在谷氨酸合酶的作用下将谷氨酰胺的酰胺转化到酮戊二酸中，从而生成 两分子的谷氨酸。GS/G0GAT是高等植物氮同化的主要途径，目前在茶树中已相继克隆得到 谷氨酰胺合成酶的编码基因 GS1;1基因，其可以受转录因子Dof，14-3-3蛋白的调控，从而参 与植物的氮素代谢过程。 microRNA(miRNA)是由18-25个核苷酸组成的非编码RNA，首先由基因组转录，形成 带帽状结构和多聚腺苷酸尾巴的初级11^1?祖(？1'；[-11111?祖）。？1'；[-11111?嫩经核酸酶01'081^处理 后形成约70nt的含茎环结构的前体miRNA(pre-miRNA)，其后又经核酸酶剪切为成熟的 miRNA^iRNA通过碱基非完全配对与靶基因 mRNA3'utr序列结合，引导沉默复合体（1?财-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或抑制mRNA的翻译，从而调控基因表达。一个 miRNA可结合多个革E1基因，而一个mRNA也可由多个miRNA共同调节。这个复杂的调节网络即 可通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基 因的表达。 近年来，对于植物miRNA及其生物学功能的研究已成为热点，研究对象主要集中在 模式植物拟南芥和水稻，玉米等模式作物中，而对于茶树的miRNA序列信息被发现相对较 少，通过高通量测序及直接克隆获得了部分miRNA，其功能的研究报道更为少见。公布号为 CN104830859A的专利文献公开了，该茶树miRNA的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。本专利技术通过Solexa高通量测序技术、生物信息学分析等技术，首次从茶树浙 农139中鉴定了 miR156及其前体Cs-miR156g，并通过不同氮素处理验证了不同氮素条件下 miR156的表达差异，得出儿茶素总量与miR156呈显著负相关关系的结论，证明本专利技术茶树 miRNA(miR156)及其前体Cs-miR156g在调控茶树儿茶素表达中起到重要作用，茶树miRNA (miR156)及其前体Cs-miR156g的表达可抑制茶树中儿茶素的合成，在优质茶叶品种的培育 中具有潜在应用价值。 因此，借鉴上述方法进一步发掘和鉴定茶树中的miRNA，对其革E1基因进行鉴定，尤 其是调控茶树氮素代谢的miRNA，从而在转录后水平调控茶树的氮素代谢，提高茶树的氮素 利用效率，改善茶叶的品质。
技术实现思路
本专利技术提供了一种茶树特异miRNA及其应用，该miRNA能够调控茶树的氮素代谢， 可应用于提高茶树氮素利用效率，改良茶叶的品质。 一种茶树miRNA，碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。 本专利技术的茶树miRNA是从茶树浙农139品种幼苗的新梢中提取筛选得到，命名为 miR32,利用5'RLM-race技术鉴定茶树miR32的靶基因 NCBI登录号为AB115183,该靶基因为 茶树谷氨酰胺合成酶的编码基因 GS1; 1。谷氨酰胺合成酶是茶树氮素代谢中的关键酶，因此 本专利技术鉴定出的茶树miR32在茶树氮素代谢中起重要作用。 上述茶树miRNA的前体，碱基序列如SEQ ID N0.2所示。 转录形成上述茶树miRNA前体的DNA片段，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。 本专利技术通过生物信息学预测茶树miR32的前体序列，PCR扩增，得到转录形成茶树 miR32前体的DNA片段，测序得至IjDNA片段的核苷酸序列信息，进而分析出茶树miRNA前体的 喊基序列。 本专利技术将转录形成茶树miR32前体的DNA片段插入了载体中得到重组质粒，有利于 茶树miR32的稳定保存。可根据具体情况选用合适的载体，作为优选原始载体可为pCAMBIA 系列的植物表达载体，具体可选用PCAMBIA1301。 本专利技术还提供了上述的茶树miRNA在抑制谷氨酰胺合成酶基因 GS1;1表达中的应 用。 本专利技术采用烟草瞬时表达技术证明茶树miR32抑制谷氨酰胺合成酶基因 GS1;1的 表达，茶树miR32作用于靶基因 mRNA的3'UTR序列。 本专利技术提供了上述茶树miRNA在调控茶树氮素代谢中的应用。 谷氨酰胺合成酶参与植物体内氮代谢的最主要途径。miR32表达上调时，GS1;1表 达呈现下调。反之miR32表达下调时，GS1; 1表达呈现上调。因此通过miR32基因可控制GS1; 1 的表达，从而实现茶树氮代谢调控。 本专利技术提供了上述茶树miRNA的前体在调控茶树氮素代谢中的应用。 本专利技术具备的有益效果：本专利技术通过Solexa高通量测序技术、生物信息学分析、 RT-PCR等技术，首次从茶树浙农139品种中鉴定了 miR32及其前体。通过5'RLM-race、烟草瞬 时表达、实时荧光定量PCR等技术，证明miR32可以负调控茶树GS1; 1基因表达。通过GS1; 1在 拟南芥中过表达验证其在茶树氮素代谢中的重要作用，表明miR32参与调控茶树氮素代谢， 提高茶树氮肥利用效率，改善茶叶品质如提高茶氨酸含量等方面具有潜在应用价值。【附图说明】 图1为茶组植物miR32前体比对。 图2为miR32的前体结构。 图3为注射不同载体的烟草叶片GUS染色观察，其中(A)单独注射miR32;(B)单独注 射空载PCMBIA1301; (C)单独注射GS1; 1; (D)共注射miR32和GS1; 1。图4为miR32及GS1;1在缺氮处理下的表达分析，其中（A)缺氮2h，miR32表达情况； (B)缺氮48h，miR32表达情况；（C)缺氮2h，GSl; 1表达情况；（D)缺氮48h，GSl; 1表达情况。 图5为在不同氮素处理下miR32及GS1;1的表达情况，其中（A)和(B)分别为芽叶和 根中miR32的表达分析，（C)和(D)分别为芽叶和根中GS1; 1的表达分析。图6为转基因拟南芥在不同浓度铵条件下培养的形态观察结果，其中A1和A2为对 照;B1和B2为4mM铵条件下生长情况;C1和C2为20mM铵条件下生长情况。 图7为转基因拟南芥在不同浓度铵条件下的生物量测定结果，其中(A)为莲座叶鲜 重；（B)为根鲜重；（C)为抽薹莖鲜重。 图8为转基因拟南芥的生化指标测定结果，其中（A)为游离氨基酸含量测定结果； (B)为可溶性糖含量测定结果。【具体实施方式】下面结合具体实施例对本专利技术作进一步的阐述和说明，但本专利技术所保护范围不限 于此。下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，所用的材料、试 剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中获得。 实施例lmiR32的发掘和鉴定 1.植物材料和样品的准备 取茶树(Camellia sinensis)浙农139品种一年生扦插苗，置于人工气候室中水 培，采摘茶树幼苗的一芽二叶，液氮速冻后，-70 °C冰箱冷冻备用。 2.茶树本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种茶树miRNA，其特征在于，碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王校常，范凯，范冬梅，陆鹏，陆亚婷，俞辉，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33