本发明专利技术公开了一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方法。其中，引物组包括用于接头包埋的SEQ ID NO：1-3所示的序列，以及用于PCR扩增的SEQ ID NO：4-5所示的序列。本发明专利技术提供的引物组使得TN5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于Ion Proton的文库，构建的文库可以直接上机测序。不仅摒弃了原始的复杂文库构建程序，而且操作简单，测序结果稳定。
【技术实现步骤摘要】
[00011本专利技术涉及测序
，尤其是一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引 物组、试剂盒和建库方法。
技术介绍
生命技术(Life Technologies)公司研发的Ion Proton?基因测序仪采用了新一 代半导体测序技术。该系统拥有快速、简单及可扩展等特征，能有效推进临床研究在癌症及 遗传性疾病等诊断中的发展。但是在上机文库构建中，依然需要传统的DNA片段化、加接头、 修复、片段选择等操作，过程繁琐，耗时较长。并且所需要的DNA起始量较高，不适合微量体 系（<10ng)建库。虽然该公司在后期开发了基于MuA转座子的MuSeek?文库构建试剂盒 (MuSeek?Library Preparation Kit)，但是依然需要较高的DNA起始量(>50ng)，并且试剂 中的酶需要存储在_70°C冰箱中，使得一些小型、简单的实验室无法保存利用。 高度活化变异的TN5转座酶能够随机介导双链DNA的片段化并短时间内添加寡核 苷酸片段，这使得TN5能够应用于二代测序的文库制备中。但是目前商品化的TN5转座酶主 要应用于Hiseq测序仪平台中，illumina公司生产的Nextera DNA kits即是此类快速高效 制备文库的代表。其它平台未见其应用。因此，亟需开发一种技术，使得TN5转座酶能够适于 Ion Proton?的文库构建。
技术实现思路
本专利技术提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组、试剂盒和建库方 法，使得TN5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于Ion Proton的文库，构建的文库可以直 接上机测序。 根据本专利技术的第一方面，本专利技术提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的 引物组，该引物组包括用于接头包埋的SEQ ID N0:l-3所示的序列，以及用于PCR扩增的SEQ ID N0:4-5所示的序列。 作为本专利技术的进一步改进的方案，上述引物组还包括用于PCR扩增的SEQ ID N0: 6-7所示的序列。 作为本专利技术的进一步改进的方案，上述用于PCR扩增的SEQ ID N0:5所示的序列具 体包括:SEQ ID NO:8-23所示的序列。 根据本专利技术的第二方面，本专利技术提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的 试剂盒，该试剂盒包括第一方面的引物组。 作为本专利技术的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括TN5转座酶，任选地还包括用 于TN5转座酶的缓冲液。 作为本专利技术的进一步改进的方案，上述试剂盒还包括用于PCR扩增的聚合酶，任选 地还包括用于上述聚合酶的缓冲液。 根据本专利技术的第三方面，本专利技术提供一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库方 法，该方法包括:使用SEQ ID N0:1-3所示的序列与TN5转座酶进行接头包埋;使用得到的包 埋复合体对DNA进行片段化处理;使用SEQ ID N0:4-5所示的序列对片段化产物进行PCR扩 增；以及对PCR扩增产物进行纯化。 作为本专利技术的进一步改进的方案，上述方法还包括:在PCR扩增过程中还使用SEQ ID N0:6-7所示的序列。 作为本专利技术的进一步改进的方案，上述SEQ ID N0:5所示的序列具体包括:SEQ ID NO :8-23所示的序列。 作为本专利技术的优选方案，上述片段化处理的DNA的起始量是50ng以下。本专利技术提供的引物组，使得τ N 5转座酶能够高效、快速、微量的构建适于I ο η Proton的文库，构建的文库可以直接上机测序。本专利技术不仅摒弃了原始的复杂文库构建程 序，而且操作简单，测序结果稳定。文库构建可在lh内完成，特别是DNA建库起始量可以达到 纳克级（l-l〇ng)，极大地促进了Ion Proton?基因测序仪的应用和整体测序速度。【附图说明】 图1为本专利技术一个实施方案的Ion Proton测序平台的TN5建库方法流程图； 图2为本专利技术实施例1得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结果图； 图3为本专利技术实施例1得到的文库的基因表达数量检测图； 图4为本专利技术比较例1的引物组一得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结 果图； 图5为本专利技术比较例1的引物组二得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结 果图； 图6为本专利技术比较例1的引物组三得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结 果图； 图7为本专利技术比较例1的引物组四得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结 果图； 图8为本专利技术比较例1的引物组五得到的文库使用安捷伦2100生物分析仪检测结 果图。【具体实施方式】 下面通过【具体实施方式】结合附图对本专利技术作进一步详细说明。 专利技术人经深入研究和筛选得到一组可以用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引 物组，使用该组引物能够使得TN5转座酶高效、快速、微量的构建适于Ion Proton的文库，构 建的文库可以直接上机测序。需要说明的是，在实际应用中，需要经过反复试验筛选才能得到可用的引物，本发 明的专利技术人还尝试使用其它序列作为引物用于Ion Proton测序平台的TN5建库，难以获得 成功，而出乎意料地发现本专利技术的引物组不但能够实现基本的建库功能，而且具有高效、快 速、微量的特点。本专利技术的引物组包括表1所示的几条引物，其中SEQ ID N0:l-5所示的引物为必需 引物，而SEQ ID N0:6-7为进一步可以包括的引物。在不包括SEQ ID N0:6-7的情况下，也能 实现基本的PCR扩增功能；而在包括SEQ ID NO:6-7的情况下，能够实现嵌套式PCR扩增功 能，增加敏感性和可靠性。表 1 表1中，SEQ ID N0:1-3所示的序列用于接头包埋，其中Tn5-M是短接头序列，而 Tn5-M-A-Ion和Tn5-M-P-Ion是长接头序列，短接头序列分别与两条长接头序列形成配对， 与TN5转座酶包埋形成包埋复合体。 本专利技术中，PCR扩增至少需要两条引物序列，即IonAdapter-P和IonAdapter-A，其 中1〇1^0^七61-?是序列固定的序列，而1〇1^0^七61-六含有标签(1^11'(3〇(16)序列""，其 中标签序列用于区分不同的样本，因此也可以称为"样本标签序列"。标签序列可以采用目 前高通量测序中通用的标志（index)序列。一般只要能够区分出样本且不干扰测序即可，可 以是一段连续的随机序列，长度一般大于6bp，比如8bp、10bp或12bp等。本专利技术一个实施例 中使用的标签序列的长度是l〇bp，因此SEQ ID N0:5所示的IonAdapter-A序列中的可 以是10个连续的随机碱基，即"NNNNNNNNNN"，也就是说本专利技术中的SEQIDN0 :5所示的 IonAdapter-A序列可以表示为如下序列： 57-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGATGCTGGCTGACGGGAT-3'。 然而，应当理解的是，本专利技术中SEQ ID N0:5所示的序列并不局限于标签序列是 "NNNNNNNNNN"的序列，而是任何只要标签序列互不相同、而其它部分序列相同的引物组。 因此，SEQ ID N0:5所示的序列实际上可以包括一组具有不同标签本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于Ion Proton测序平台的TN5建库的引物组，其特征在于，所述引物组包括用于接头包埋的SEQ ID NO：1‑3所示的序列，以及用于PCR扩增的SEQ ID NO：4‑5所示的序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王磊，李贵波，禹奇超，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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