本发明专利技术公开了一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的方法，采用高效液相色谱串联二级质谱技术分别检测标准品溶液和经过预处理的尿液样品中的8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷，先利用高效液相色谱技术将8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷分离，再利用二级质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出8-羟基脱氧鸟苷和8-羟基鸟苷的含量。与现有技术相比，本发明专利技术方法高效稳定，回收率和稳定性良好，具有准确、简便、经济、高效等优点，适于临床检测中推广应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生化检测领域，具体设及一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿 液中8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧的方法。
技术介绍
DNA和RNA氧化损伤应激产物作为生物标记物的潜在用途和价值是生物医学研究 的一个重要方面。8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧作为两种重要的氧化标记物，在组织细胞 内产生，经血液运输，由肾脏随尿液排出体外。由于两种物质在体内较为稳定，且尿液样本 易得，可W实现无创检测，通过对尿液中两种物质的监测可W为有效评价机体各种因素引 起的氧化损伤提供帮助。此外，通过对健康人体内两种生物标记物的含量检测，可W评估性 另IJ、年龄和吸烟等潜在因子的影响作用。因此，开发一种经济、高效的8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧检测方法至关重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液 中8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧的方法，W解决现有技术存在的方法复杂，特异性较差和 灵敏度低的问题。 为解决上述技术问题，本专利技术要解决的技术方案如下： -种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧 的方法，它采用高效液相色谱串联二级质谱技术分别检测标准品溶液和经过预处理的尿液 样品中的8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧，先利用高效液相色谱技术将8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧分离，再利用二级质谱同位素内标定量法，W标准品与内标物的浓度比为X轴，标 准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧的含 量，具体色谱条件为： (1)高效液相色谱条件： 流动相A: 0.1 % v/v的甲酸水溶液；[000引流动相B:甲醇； 色谱柱为叫timate Polar-RP,2. IX 100mm，3皿； 流速为 0.4mL/min;[001" 柱溫为30。。[001^ 进样量化0化； 采用梯度洗脱方式，见表1; 表1液相梯度洗脱参数 (2)质谱条件： 在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式;喷雾针电压 为5500V;碰撞气为5psi;气帘气为50psi;离子源雾化气和加热辅助气均为65psi;脱溶剂气 溫度为550°C。 其中，所述的标准品溶液按照如下方法制备得到： 分别准确称量5mg的8-径基脱氧鸟巧和8-径基鸟巧，于甲醇中溶解定容至IOmL,配 制成浓度分别为0.48mg/mL和0.485mg/mL的储备液A和B，-20°C保存;取储备液A和B各100化 混合后用甲醇稀释后定容至IOmL,配制成8-径基脱氧鸟巧浓度为4.祉g/mL，8-^基鸟巧浓 度为4.85iig/mL的混合标准液Cl，-20°C保存;取10化L混合标准液Cl用空白人工尿液基质稀 释后定容至5mL，配制得到8-径基脱氧鸟巧浓度为96ng/mL，8-^基鸟巧浓度为97ng/mL的混 合标准液C2;取50化L混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释后定容至5mL，配制得到8-径 基脱氧鸟巧浓度为9.6ng/mL，8-径基鸟巧浓度为9.化g/mL的混合标准液C3; 准确称量5mg的-8-径基脱氧鸟巧，用甲醇溶解定容至IOmL后得到浓度为 49.55iig/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.99 liig/mL得到内标物工作液D; 内标物储备液和内标物工作液D均于-20°C下保存； 分别取25iil、5化L和10化L混合标准液C2用空白人工尿液基质稀释并定容至10化L 作为标准校准点S5、S6和S7;分别取扣L、10化、5化L和10化L混合标准液C3用空白人工尿液 基质稀释并定容至I(K)化，得到标准校准点S1、S2、S3和S4;运7个浓度点体积均为I(K)化;然 后向各组标准校准点中加入15化0.99liig/mL内标物工作液D，混合均匀后用甲醇定容至 〇.5mL，然后满旋20秒后振荡lOmin，于4°C下12000g离屯、5min后取10化上清液，即得标准品 溶液； 其中， Sl、S2、S3、S4、S5、S6和S7作为8-径基脱氧鸟巧的校准点，S2、S3、S4、S5、S6和S7作 为8-径基鸟巧的校准点。 其中，所述的空白人工尿液基质为实验室人工配置的模拟尿液;其中，所述的空白 人工尿液基质由如下方法制备得到：分别取0.5586g二水合氯化巧、0.6099g六水合氯化儀、4.2077g氯化钢、2.0596g硫 酸钢、O . 6470g巧樣酸钢二水合物、O . 0201g草酸钢、2.5449g憐酸二氨钟、1.4388g氯化钟、 0.9200g氯化锭、2.4985g尿素和1.0520g肌酢用去离子水溶解并定容至IL。 其中，尿液样品的预处理方法为:取10化L尿液至1.5mL离屯、管中，加入15化内标物 工作液D后混匀，再用甲醇定容至0.5血，縱满振荡Imin，于4°C下12000g离屯、5min，取10化上 清液即可。其中，准确称量5mg的-8-径基脱氧鸟巧，用甲醇溶解定容至IOmL后得到 浓度为49.5化g/mL的内标物储备液，内标物储备液经甲醇稀释至0.99化g/mL得到内标物工 作液D;内标物储备液和内标物工作液D均于-20°C下保存。[002引有益效果： 与现有技术相比，本专利技术方法高效稳定，回收率和稳定性良好（批内精密度在 3.63 %~6.39 %之间，批间精密度在3.88 %~9.35 %之间，批内和批间RSD均在10 % W内， 平均回收率在91.90 %~116.76%之间），具有准确、简便、经济、高效等优点，适于临床检测 中推广应用。【附图说明】 图Ia为标准品中8-径基脱氧鸟巧定量离子对的选择离子流色谱图； 图化为标准品中8-径基脱氧鸟巧定性离子对的选择离子流色谱图； 图Ic为标准品中8-径基鸟巧定量离子对的选择离子流色谱图； 图Id为标准品中8-径基鸟巧定性离子对的选择离子流色谱图； 图Ie为标准品中-8-径基脱氧鸟巧的选择离子流色谱图； 图If为标准品中-8-径基脱氧鸟巧的选择离子流色谱图； 图2a为尿液样品中8-径基脱氧鸟巧定量离子对的选择离子流色谱图； 图化为尿液样品中8-径基脱氧鸟巧定性离子对的选择离子流色谱图； 图2c为尿液样品中8-径基鸟巧定量离子对的选择离子流色谱图； 图2d为尿液样品中8-径基鸟巧定性离子对的选择离子流色谱图； 图化为尿液样品中-8-径基脱氧鸟巧的选择离子流色谱图； 图2f为尿液样品中-8-径基脱氧鸟巧的选择离子流色谱图。【具体实施方式】 根据下述实施例，可W更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 专利技术。 实施例1 1、材料 方法学研究实验的样本来自于上海迪安医学检验所员工的尿液样本。 (1)仪器：LC-20AD液相色谱仪（岛津，日本）、API4000+S重四极杆质谱仪（AB Sciex,美国）、优普超纯水机(超纯，成都）、多管满旋混合仪(杭州奥盛仪器有限公司）；快速 混匀器(新康，江苏）、高速冷冻离屯、机（白洋，北京）、色谱分离柱为叫timate化Iar-RP 3皿 2. IX 100、可调移液器（ThermoFisher，0.5~10化，10~100化，100~1000化）本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种高效液相色谱串联二级质谱技术检测尿液中8‑羟基脱氧鸟苷和8‑羟基鸟苷的方法，其特征在于，采用高效液相色谱串联二级质谱技术分别检测标准品溶液和经过预处理的尿液样品中的8‑羟基脱氧鸟苷和8‑羟基鸟苷，先利用高效液相色谱技术将8‑羟基脱氧鸟苷和8‑羟基鸟苷分离，再利用二级质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算出8‑羟基脱氧鸟苷和8‑羟基鸟苷的含量，具体色谱条件为：(1)高效液相色谱条件：流动相A：0.1％v/v的甲酸水溶液；流动相B：乙腈；色谱柱为Ultimate Polar‑RP，2.1×100mm，3μm；流速为0.4mL/min；柱温为30℃；进样量为10μL；采用梯度洗脱方式，见表1；表1液相梯度洗脱参数(2)质谱条件：在电喷雾电离正离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾针电压为5500V；碰撞气为5psi；气帘气为50psi；离子源雾化气和加热辅助气均为65psi；脱溶剂气温度为550℃。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张卫卫，于嘉屏，
申请(专利权)人：上海迪安医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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