一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂制造技术

本发明专利技术提供了一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂，该储存试剂包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl 60～90mM、氯化钙25～75mM、氯化镁25～75mM、乙二醇20～35％(v/v)和DTT 2～4mM；溶剂为去离子水。本发明专利技术提供的储存试剂对生无机焦磷酸酶活性有保护作用，能够延长生物素化无机焦磷酸酶的储存时间，减少反复冻融对其活性的影响；还能够有效减少无机焦磷酸酶上生物素标签的脱落。

【技术实现步骤摘要】
一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂
本专利技术属于生物
，具体涉及一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂。
技术介绍
无机焦磷酸酶(InorganicPyrophosphatase,PPase,EC3.6.1.1)是一类催化焦磷酸(Pyrophosphoricacid，PPi)水解为正磷酸的酶。PPase通过分解PPi可为多种生物合成途径提供能量，并推动其向合成方向进行。例如，葡萄糖和淀粉的合成、纤维素合成、氨酰tRNA合成、脂酰辅酶A合成、DNA和RNA的聚合等。PPase广泛存在于自然界，随着技术手段的发展，现已成功地从日本吸血虫、水稻、大麦、烟草、酵母、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌以及嗜热细菌中获得了PPase的cDNA克隆。PPase在催化反应中，需要结合三或四个2价金属阳离子，例如二价镁离子(Mg2+)。PPase在体外具有增强DNA聚合酶的扩增效率以及增强RNA聚合酶在体外转录反应中的产量的功能。除此之外，PPase在焦磷酸测序等DNA测序技术中发挥重要作用。焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是利用生物发光反应进行序列测定的新一代测序技术。其基本原理为：在每一轮测序反应中，只加入四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)中的一种，若该dNTP能够与DNA模板的下一个碱基配对，则会在DNA聚合酶的催化下，将其掺入到测序引物链的3’末端，同时释放出一分子的PPi；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi可以和5’-磷酰硫酸(Adenosine-5’-phosphosulfat，APS)结合形成等量的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)；生成的ATP在荧光素酶的催化下，可以和荧光素结合形成氧化荧光素，同时产生可见光，通过微弱光检测装置及处理软件可获得一个特异的检测峰，峰值的高低则和相匹配的碱基数成正比；如果加入的dNTP不能和DNA模板的下一个碱基配对，则上述反应不会发生，也就没有检测峰；反应体系中剩余的dNTP和残留的少量ATP在三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)的作用下发生降解；待上一轮反应完成后，加入另一种dNTP，使上述反应重复进行，根据获得的峰值图即可读取准确的DNA序列信息。近年来出现了一种高通量光导纤维微反应池阵列焦磷酸测序技术，该技术一次可以测定上百万个样品，其出现带来了测序技术的革命，极大地推动了后基因组计划的发展。在上述高通量焦磷酸测序技术中，除了DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶以外，PPase是另一个重要用酶，其作用是通过清除多余的PPi来减少每一轮碱基加入期间反应仓微孔之间的交叉干扰，并且能够降低测序反应中的背景噪音。用于高通量焦磷酸测序技术的PPase通常是被生物素化修饰的，以便于将其通过链亲合素固定于测序微球表面。尽管已有许多针对不同酶蛋白的储存试剂或保护试剂被公开或被商业化利用，但目前并没有专门针对生物素化PPase的储存试剂。众所周知，每种酶蛋白的催化特性不同，因此在不同的储存试剂中活性的稳定性也不同。对于焦磷酸测序反应而言，PPase的酶活直接影响到测序反应中背景噪音的强弱和测序的精确性。储存试剂的优劣直接影响PPase在在储存、运输和销售过程中的稳定性，因而间接影响焦磷酸测序的精确性。综上所述，开发一种专门针对生物素化PPase的储存试剂，最大可能保证其在储存、运输和销售过程中的稳定性，是其在工业化生产以及实际应用中亟待解决的问题。
技术实现思路
本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。本专利技术要解决的一个问题是提供一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂，该储存试剂包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl60～90mM、氯化钙25～75mM、氯化镁25～75mM、乙二醇20～35％(v/v)和DTT2～4mM；溶剂为去离子水。上述储存试剂中，Tris-HCl的浓度优选为65～85mM；进一步优选为70～80mM；再一步优选为72～78mM。上述储存试剂中，氯化钙的浓度为优选为25～60mM；进一步优选为30～50mM；再一步优选为40～45mM。上述储存试剂中，氯化镁的浓度为优选为25～50mM；进一步优选为25～40mM；再一步优选为25～35mM。上述储存试剂中，乙二醇的浓度优选为20～30％(v/v)；进一步优选为22～28％(v/v)；再一步优选为26～28％(v/v)。上述储存试剂中，DTT的浓度优选为2.2～3.6mM；进一步优选为2.6～3.4mM；再一步优选为2.8～3.2mM。在某些优选的实施方案中，所述的生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂中还包括：硫代硫酸钠、蔗糖酯和羧甲基壳聚糖中的一种或多种。所述的硫代硫酸钠的浓度为2～5mM；优选为2～4mM；进一步优选为2～3mM。所述的蔗糖酯的浓度为20～45mM；优选为25～40mM；进一步优选为30～38mM；再一步优选为32～36mM。所述的羧甲基壳聚糖的浓度为15～35mM；优选为15～30mM；进一步优选为17～25mM；再一步优选为18～20mM。本专利技术要解决的另一个问题是提供上述生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂的使用方法：使用时，将所述的储存试剂、生物素化无机焦磷酸酶和甘油按照1:3:3的体积比混合均匀。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的生物素化无机焦磷酸酶储存试剂，对生无机焦磷酸酶活性有保护作用，使得生物素化无机焦磷酸酶在-80℃、-20℃和4℃下放置3个月，活性几乎不变；在-80℃、-20℃和4℃下放置6个月，能够维持>97％的残余活力。此外，在25℃、30℃和35℃下放置12h，活性几乎不变；在25℃、30℃和35℃下放置48h，能够维持>96％的残余活力。本专利技术提供的生物素化无机焦磷酸酶储存试剂在以上各个储存条件下对无机焦磷酸酶的活性保护均优于常规50％甘油的储存条件。加入本专利技术提供的储存试剂后，生物素化无机焦磷酸酶在冻融3次和6次后，活性不变；在冻融9次后，均能够维持>96％的残余活力；在冻融15次后，均能够维持>92％的残余活力。而在50％甘油中，生物素化无机焦磷酸酶在反复冻融15次后，仅剩22.9％的残余活力；不加任何试剂的生物素化无机焦磷酸酶在反复冻融15次后，仅剩9.7％的残余活力。加入本专利技术提供的储存试剂后，生物素化无机焦磷酸酶在反复冻融9次和15次后，分别仅有2.7％和3.1％左右的酶蛋白上的生物素标签脱落。而在50％甘油中，在反复冻融6次、9次和15次后，分别有7.9％、9.2％和11.6％的酶蛋白上的生物素标签脱落。综上所述，本专利技术提供的储存试剂对生无机焦磷酸酶活性有保护作用，能够延长生物素化无机焦磷酸酶的储存时间，减少反复冻融对其活性的影响；还能够有效减少无机焦磷酸酶上生物素标签的脱落。具体实施方式如无特殊说明，本专利技术涉及的化学或生物试剂均购自Sigma-Aldrich公司；分光光度计购自上海谱元仪器有限公司，型号为Alpha1506。实施例1一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl90mM、氯化钙75mM、氯化镁75mM、乙二醇35％(v/v)和DTT4mM；溶剂为去离子水。实施例2一种本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂，其特征在于：所述的储存试剂包括以下组分：pH8.5的Tris‑HCl60～90mM、氯化钙25～75mM、氯化镁25～75mM、乙二醇20～35％(v/v)和DTT 2～4mM；溶剂为去离子水；所述的储存试剂的使用方法为：将所述的储存试剂、生物素化无机焦磷酸酶和甘油按照1:3:3的体积比混合均匀。

【技术特征摘要】
1.一种生物素化无机焦磷酸酶的储存试剂，其特征在于：所述的储存试剂包括以下组分：pH8.5的Tris-HCl60～90mM、氯化钙25～75mM、氯化镁25～75mM、乙二醇20～35％(v/v)、DTT2～4mM、硫代硫酸钠2～5mM、蔗糖酯20～45mM和羧甲基壳聚糖15～35mM；溶剂为去离子水；所述的储存试剂的使用方法为：将所述的储存试剂、生物素化无机焦磷酸酶和甘油按照1:3:3的体积比混合均匀。2.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：高静，蔡亦梅，吴超，徐潇，张睿，王者馥，王绪敏，殷金龙，任鲁风，
申请(专利权)人：北京中科紫鑫科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：北京;11