一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，将葡聚糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠，在30℃的条件下避光反应2小时，然后用超纯水进行透析纯化，将透析后的溶液真空冷冻干燥，得到醛基葡聚糖，将醛基葡聚糖溶于PBS中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入戊二醛，室温避光振荡4小时，利用共价嫁接的方法，使醛基葡聚糖和戊二醛共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠；将谷氨酸溶于PBS中，加入醛基磁珠中，室温振荡4小时，然后加入硼氢化钠，继续振荡反应2小时，获得羧基磁珠。本发明专利技术形成的单分散磁珠更有利于下游嫁接生物分子的顺利进行而不影响生物分子的活性，同时磁珠表面羧基密度的提高使嫁接生物分子的效率更高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于氨基磁珠表面涂覆葡聚糖的羧基磁珠制备方法及其应用。
技术介绍
磁珠，即磁性微珠或磁性微球，它是一类具有超顺磁性，直径为纳米或微米级的球形复合物，可在外加磁场的作用下向磁场移动，从而达到分离目标产物的目的。磁珠的表面带有不同的功能团，根据表面功能团的不同可分为氨基磁珠，羧基磁珠，环氧基磁珠等。磁珠表面的功能团可以共价嫁接各种生物分子或小分子，可用于下游的生物实验。葡聚糖是由葡萄糖单位组成的多聚糖，葡聚糖含有丰富的醇羟基使其改性后易于与其他化合物反应，并且葡聚糖与蛋白质的低作用性和细胞对其耐受性及其无毒性，使得以葡聚糖为生物材料的表面涂层成为研究热点。谷氨酸，是生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，分子内含有两个羧基。谷氨酸又分左旋体、右旋体和外消旋体。左旋体，即L-谷氨酸，它是一种鳞片状或粉末状晶体，呈微酸性，无毒。一般表面含羧基功能团的磁珠与小分子、生物大分子或其他化合物的嫁接方法种类较多，嫁接方法易于操作，但嫁接之后存在的问题是嫁接率较低和嫁接后因磁珠表面的非特异吸附以及空间位阻的限制导致生物分子空间结构改变最终使生物分子失去活性，从而造成下游生物实验得率低和某些大分子无法发挥其活性作用等。本专利技术旨在解决目前一般羧基磁珠嫁接含氨基的化合物存在的上述问题，提供了一种新的羧基磁珠的制备方法以及羧基磁珠的各种应用。专利公开号TW200702661公开了一种生物检测用之磁性奈米粒子及其制备方法BIO-COMPATIBLEMAGNETICNANOPARTICLESANDPREPARATIONMETHODTHEREFOR，该专利技术利用高碘酸钠氧化表面被覆有葡聚糖之磁性奈米粒子，以形成于该磁性奈米粒子上形成醛基，并进而使其与卵白素结合，因此可以采用经硷性磷酸标定之生物素，利用卵白素与生物素可于室温共价结合之特性，以酵素连结免疫吸附分析法检测之。可应用于将磁性奈米粒子与其他生物分子如去氧核糖核酸(deoxyribosenμcLeicacid，DNA)、抗体或抗原等相结合，并进一步应用于动物、植物及微生物病毒之检测，故极具产业应用价值。专利公开号CN101143888公开了一种免疫纳米磁性葡聚糖微球的制备方法，共沉淀法制备纳米级的磁性氧化铁粒子；配成亚铁离子∶铁离子∶镍离子为1∶(1.0-4.0)∶(0.2-0.8)摩尔比溶液；葡聚糖包裹磁性氧化铁粒子；纳米磁性葡聚糖微球的蛋白的连接。优点在于，实现了粒径窄，重复性好，价格低廉，使免疫纳米葡聚糖磁性微球具有天然活性的。专利公开号CN101759882A公开了一种交联葡聚糖磁性复合微粒及其制备方法及其使用，该复合微粒包括磁性纳米颗粒和具有交联结构的葡聚糖，其中磁性纳米颗粒分散在具有交联结构的葡聚糖中。该复合微粒的制备方法为：配制葡聚糖溶液、合成葡聚糖磁性复合微粒、合成交联葡聚糖磁性复合微粒。该复合微粒的使用步骤：制载抗癌药物的交联葡聚糖磁性复合微粒、在其中加入缓释液释药。本专利技术解决了现有葡聚糖磁性复合微粒的磁响应性弱、包载量小的技术问题，所制备的交联葡聚糖磁性复合微粒具有强的磁响应性，载药量大，能够高度浓集抗癌药物的特点，能够通过磁场的定位和药物的缓释作用于靶向细胞。专利公开号CN102430130A公开了一种医药用改性葡聚糖包覆磁性纳米颗粒复合材料及其制备，该本专利技术的方法是在溶剂热条件下进行的反应过程，制备得到亲水性强、生物亲和性好、能用于抗体和细胞分离以及医学核磁共振成像对比剂的四氧化三铁及一系列铁酸盐纳米颗粒，得到的颗粒在水中有很好的稳定性，高浓度胶体至少5个月内不沉淀，且纳米颗粒粒径分布均匀，合成成本相对低廉。专利公开号CN103347543A公开了涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的制备方法和使用其的磁共振成像造影剂，该专利技术涉及通过用亲水材料涂覆氧化铁纳米颗粒以制备生物相容的氧化铁纳米颗粒的方法，以及包括由此制备的氧化铁纳米颗粒的磁共振成像(MRI)造影剂，所述氧化铁纳米颗粒通过使用盐粒进行退火处理而磁性提高。在亲水材料中，羧甲基葡聚糖(CM-葡聚糖)对稳定退火的氧化铁纳米颗粒和显示对比效果而言是最有效的。以上专利技术多是将葡聚糖交联让磁性颗粒镶嵌其中，没有明显的葡聚糖与磁珠之间的键合反应；或者利用醛基葡聚糖作为终产物直接嫁接生物分子等，醛基本身易被氧化，不稳定，不易存放。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于氨基磁珠表面嫁接葡聚糖的羧基磁珠制备方法及其用途，以解决目前羧基磁珠在共价嫁接蛋白时存在的偶联效率低和非特异性吸附高等问题以及拓宽羧基磁珠的应用领域。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，步骤如下：（1）醛基葡聚糖的制备：将葡聚糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠，在30℃的条件下避光反应2小时，然后用超纯水进行透析纯化，将透析后的溶液真空冷冻干燥，得到醛基葡聚糖；（2）醛基磁珠的制备：将醛基葡聚糖溶于PBS中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入戊二醛，室温避光振荡4小时，利用共价嫁接的方法，使醛基葡聚糖和戊二醛共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠；（3）羧基磁珠的制备：将谷氨酸溶于PBS中，加入醛基磁珠中，室温振荡4小时，然后加入硼氢化钠，继续振荡反应2小时，获得羧基磁珠。所述步骤（1）中葡聚糖分子量为10-70Kda，葡聚糖在超纯水中的浓度为50mg/mL。所述步骤（1）中葡聚糖以其单糖为单位，高碘酸钠与葡聚糖的摩尔比1：2。所述步骤（2）中，醛基葡聚糖与戊二醛的质量比为2：1至1:10，优选为1:5。所述步骤（3）中谷氨酸与醛基磁珠的质量比是1：1。所述步骤（3）中谷氨酸在PBS中的浓度为5mg/mL。利用所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法制备得到的涂覆葡聚糖的羧基磁珠共价偶联ProteinA蛋白后，从血浆、血清或腹水中纯化IgG。本专利技术的有益效果：本专利技术方法所制得的羧基磁珠具有以下优点：1、增加了磁珠表面功能团（羧基基团）的密度；2、戊二醛的易反应性和葡聚糖的惰性两者的协同作用降低了磁珠表面的非特异性吸附作用；3、葡聚糖的支链和谷氨酸分子增加了磁珠与表面功能团之间的间隔臂长度，从而使蛋白、核酸、细胞、抗体或者一般化合物等更有效地嫁接到磁珠表面。4、嫁接蛋白、含氨基核酸、抗体等生物分子后的磁珠可用于生物分子富集、生物分离纯化、生物检测、细胞分选、免疫分析及检测等多个领域。5、本专利技术不仅是在磁珠上键合氧化葡聚糖，并且利用氧化葡聚糖与戊二醛混合形成交联致密的涂覆层，即利用了戊二醛的易反应性又利用了葡聚糖的惰性，两者的协同作用即增加了氨基的覆盖率又降低了磁珠表面的非特异性吸附作用。然后再嫁接谷氨酸从而获得羧基磁珠。这种制备羧基磁珠的方法不仅将葡聚糖更有效地包覆在磁珠表面，同时用谷氨酸延长了磁珠表面与羧基之间的间隔臂，增加了羧基含量，形成的单分散磁珠更有利于下游嫁接生物分子的顺利进行而不影响生物分子的活性，同时磁珠表面羧基密度的提高使嫁接生物分子的效率更高。附图说明图1为本专利技术羧基葡聚糖磁珠合成路线示意图。图2为实施例1~4制得的ProteinA磁珠从血浆中纯化的IgG的聚丙烯酰胺凝胶电泳（1-实施例1；2-实施例2；3-实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于步骤如下：（1）醛基葡聚糖的制备：将葡聚糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠，在30℃的条件下避光反应2小时，然后用超纯水进行透析纯化，将透析后的溶液真空冷冻干燥，得到醛基葡聚糖；（2）醛基磁珠的制备：将醛基葡聚糖溶于PBS中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入戊二醛，室温避光振荡4小时，利用共价嫁接的方法，使醛基葡聚糖和戊二醛共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠；（3）羧基磁珠的制备：将谷氨酸溶于PBS中，加入醛基磁珠中，室温振荡4小时，然后加入硼氢化钠，继续振荡反应2小时，获得羧基磁珠。

【技术特征摘要】
1.一种基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于步骤如下：（1）醛基葡聚糖的制备：将葡聚糖溶于超纯水中，加入高碘酸钠，在30℃的条件下避光反应2小时，然后用超纯水进行透析纯化，将透析后的溶液真空冷冻干燥，得到醛基葡聚糖；（2）醛基磁珠的制备：将醛基葡聚糖溶于PBS中，加入到氨基磁珠中，再向氨基磁珠中加入戊二醛，室温避光振荡4小时，利用共价嫁接的方法，使醛基葡聚糖和戊二醛共同嫁接到氨基磁珠表面制得醛基磁珠；（3）羧基磁珠的制备：将谷氨酸溶于PBS中，加入醛基磁珠中，室温振荡4小时，然后加入硼氢化钠，继续振荡反应2小时，获得羧基磁珠。2.根据权利要求1所述的基于涂覆葡聚糖的羧基磁珠的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中葡聚糖分子量为10-70Kda，葡聚糖在超纯水中的浓度为50mg/mL。3.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：李培培，王辉，王知丰，黄明贤，
申请(专利权)人：郑州英诺生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：河南;41