一种与猪精液品质性状相关的遗传标记及应用制造技术

本发明专利技术属于猪遗传标记筛选与应用技术领域，具体涉及一种与猪精液品质性状相关的遗传标记及应用，该遗传标记是从猪RNF4基因3’非翻译区克隆得到，其单核苷酸多态性(SNP)可以作为猪精液品质性状的遗传标记，该遗传标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示，在序列表SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4序列的487bp处存在一个等位基因突变，该突变导致AluI-RFLP多态性。本发明专利技术筛选步骤为：从猪血液中提取基因组DNA，设计引物，PCR扩增，PCR产物克隆、测序，序列比较分析，单核苷酸多态性检测，标记与精液品质性状间相关性分析。本发明专利技术的遗传标记可在猪标记辅助选择中应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及猪遗传标记筛选
，具体涉及一种与猪精液品质性状相关的分 子遗传标记及应用，本专利技术的遗传标记从RNF4基因3'非翻译区中获得SNP，本专利技术还包括猪 RNF4基因突变位点的检测方法与应用。
技术介绍
公猪的繁殖力在猪生产中发挥重要的作用，一般通过鉴定精液的品质来衡量公猪 的繁殖性能。精液品质的指标包括精液量、精子密度、精子形态及精子活力等。遗传作用和 环境作用是影响精液品质的两个重要因素，环境因素可以进行人为的控制和改善，但只有 提尚遗传效率才能从根本上提尚精液品质，提尚公猪的繁殖力。由于公猪繁殖性状的遗传 力低，导致常规选择进展缓慢。随着分子生物学技术的兴起和迅速发展，发展了常规育种与 标记辅助选择(MAS)相结合的方法，可以有效地加快公猪精液品质性状的选择进展。 RNF4蛋白是一个核内转录因子，在睾丸组织中高表达（Moilanen et al. Identification of an ovel RING finger protein as a co-regulator in steroid receptor-mediated gene transcription.Mol Cell Biol ,1998,18:5128-5139)。有研究 表明RNF4极有可能参与精子细胞成熟的过程，因为其mRNA和蛋白质在圆形精子和长形精子 细胞中都高表达（Yan et al.A Nuclear RING finger protein SNURF/RNF4is expressed in the last steps of spermatid maturation during rat testis development.Mech Dev，2002，118(s 1-2): 247-253) ANF4蛋白可以与雄激素受体互作在雄激素受体依赖型的 转录调控中发挥共激活因子的作用，也有研究表明RNF4可以与PATA蛋白互作，减弱雄激素 受体依赖型的转录调控能力，导致生精功能的障碍(Pero et al.PATZ attenuates the RNF4_mediated enhancement of androgen receptor-dependent transcription.J Biol Chem. 2002,277(5) :3280-3285)。我们前期的工作表明RNF4基因第五内含子中的一个单核 苷酸多态性（SNP)与母猪的产仔数性状存在显著的关联(Niu et al. Identification of polymorphism and association analysis with reproductive traits in the porcine RNF4gene.Anim Reprod Sci. 2009,110(3) :283-292),且在大白猪性成熟前后的睾丸组织 中差异表达（Luo et al .Microarray-based approach identifies differentially expressed microRNAs in porcine sexually immature and mature testes.PLoS One.2010,5(8) :ell744)，推测RNF4基因在精子发生过程中也发挥重要的作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于获得一种与猪精液品质性状相关的遗传标记，通过克隆猪RNF4 基因序列，寻找突变位点以及基因多态性的检测方法，为猪的标记辅助提供一种选择方 法。 本专利技术的技术方案如下： 本专利技术获得了一种猪精液品质性状的遗传标记，它是大白猪、梅山猪RNF4基因的 部分DNA序列，其中涉及大白猪的遗传标记是SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，涉及梅山猪 的遗传标记是SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；通过对上述序列进行MUSCLE比对发现位于 该扩增片段487碱基处存在1个C/T的等位基因突变（如图2所示），该突变导致PCR-AluI-RFLP多态性。申请人设计了一种扩增猪RNF4基因 DNA序列的引物对，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 和SEQ ID NO:2所示。 申请人提供了一种筛选猪精液品质性状的遗传标记的方法，所述的方法包括下述 步骤： 从猪血液中提取基因组DNA。登录NCBI数据库中下载猪RNF4基因序列作为靶序列， 设计特异引物(该引物的序列如序列表SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示）。以大白猪和梅山 猪的DNA为模板进行PCR扩增（图1)，对PCR产物回收和克隆测序，得到如序列表SEQ ID N0:3 (大白猪)和SEQ ID N0:4(梅山猪)所示的基因片段;进而进行序列MUSCLE比对，筛查SNP(如 图2下划线所示碱基），在序列SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4的487碱基处（即，该基因的全序 列的3'非翻译区566bp处)发现C/T等位基因突变，该突变表现了大白猪和梅山猪种间差异， 并引起了Alu頂每切位点(AG丨CT)多态性，SNP位点检测如图4所示。本专利技术提供了鉴定上述序列C/Τ变异的AluI-RFLP(限制性内切酶酶切片段长度多 态性)基因型分型方法。其引物序列分别如序列表SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示，在猪基 因组DNA中进行PCR扩增，PCR扩增片段经Alu頂每切分型及检测。 进一步，本专利技术提供了利用Alul -RFLP方法确定猪不同基因型个体与精液品质性 状间的关联分析的应用。 更详细的专利技术方案见《【具体实施方式】》所述。【附图说明】 序列表SEQIDN0:1:是制备SEQIDN0:3和SEQIDN0 :4特异基因片段所用的正 向引物。 序列表SEQ ID N0:2:是制备SEQ ID N0:3和SEQ ID N0:4特异基因片段所用的反 向引物。 序列表SEQ ID N0:3:是扩增的国外血缘猪种"大白猪"的核苷酸序列（即本专利技术的 遗传标记）。 序列表SEQ ID N0:4:是扩增的中国血缘猪种"梅山猪"的核苷酸序列（即本专利技术的 遗传标记）。 序列表SEQ ID N0:5:是实施猪RNF4基因3'非翻译区C/Τ变异的AluI-RFLP(限制性 内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的正向引物。 序列表SEQ ID N0:6:是实施猪RNF4基因3'非翻译区C/Τ变异的AluI-RFLP(限制性 内切酶酶切片段长度多态性)基因型分型方法的反向引物。 图1:是包括猪RNF4基因序列片段琼脂糖凝胶电泳图谱。琼脂糖凝胶浓度为1.5%。 附图标记说明：图中:Μ泳道为DNA Marker DL2,000;大白猪和梅山猪泳道分别如序列表SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示引物在大白猪和梅山猪种中的扩增片段，片段大小为649bp。 图2:是大白猪和梅山猪RNF4基因序列片段比对结果和SNP位点。附图标记说明：序 列表SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所示引物在不同猪种中的扩增片段，片段大小为649bp。 图2中下划线的碱基为突变碱基。图3:是实施猪RNF4基因基因型分型的引物扩增片段琼脂糖凝胶电本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与猪精液品质性状相关的遗传标记，它的核苷酸序列如下所示：AGAACGCTAACACTTGCCCAACTTGCAGGAAAAAGATCAACCACAAACGATACCACCCCATTTATATATGAAGTGTCGCGAGCTGCTCAGGAGAGTCGGATGGACAGACAGAGCCTGGCTGGGTTCGCCACGTGGCCTTATGTGGGTTCTCTGCCTCCAGTTTCTTGAGCGCAAAAAGACTGATTTCAAAATCAGCGTCTGATATGTAACTGCTCTCTTGTTTCCACCCCCCTTAGATCCTTCCTTTGCCTCTAGTTTGATGCTGTGGAGCTGGAGCTGGAGCTGGAGCCAGATCCCTCCCTGGCCAGGGTCTACACCTGCTCCTCTGGGTGGTCTGGTTCCAGGATAGGAGAGAGGGAGGGGGGCCCGTGGGAATGAACGCCGTGGTTCCAGCCTCCGTCCAGAACCCGCACATTTGCTGCGACGTTTGCCTCAGCTTCCTGCCGGCAGCGTCGTGGAGGGGCTGGCCCAGGTCGGAGAGCAAGCRGCTCCGCCAGCTCCTGTGGGCGTGCTACCTCGTCCCAGGCATCTGCCCACCCCAGTGACCAAGGCAGACAAGGTCCATCCGGCGCGAGGATCCCAAGTGTAGCACAGCCCGGAGCGACCAGCCGCTGGACTCTTCTTCCCTTGAGAGTCAGAGGTCACCGTG上述序列中487位的R是T或C，该突变导致AluI‑RFLP多态性。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李凤娥，马昌萍，李家连，牛步月，宋慧彬，胡盼娣，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42