本发明专利技术提供了一种利用ISSR分子标记鉴定巴马香猪的方法。通过将特定的DNA提取过程、特定的PCR扩增引物及特定的PCR扩增体系等特定地结合，本发明专利技术方法能在区分巴马香猪、环江香猪、藏猪、巴马本地土猪和成华猪的基础上，对未知样品进行准确鉴定，判断是否为巴马香猪。本发明专利技术鉴别快速，结果可靠，有助于促进巴马香猪产业的发展。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及生物领域，具体设及一种利用ISSR分子标记鉴定己马香猪的方法。
技术介绍
己马香猪源于广西己马瑶族自治县，为一种珍稀的，且具有地方优势的品种猪，其 肉质细嫩、香甜可口、风味独特，可用于制作腊全猪、烤乳猪、騰肉，颇受消费者青睐。但是， 随着对其需求的增加，一方面在养殖行业中出现许多杂交品种，另一方面，有些不法商贩会 将一些其他品种的乳猪(如陆川乳猪)假冒己马香乳猪用于生产烤香猪和腊香猪，产品失去 了正宗香猪的原汁原味，出现W次充好的情形。目前，其相关鉴别方法W外观描述为主，缺 乏准确的鉴定方法对未知肉制品是否为己马香猪进行鉴定。因此，市场上销售的己马香猪 肉制品真伪难辨。 DNA分子标记，也称DNA多态性标记，可直接反应DNA水平上遗传多态性，其具有W 下优点：首先，结果不受环境条件、发育阶段、及个体和生物组织器官的影响和限制；其次， 可供选择的分子标记数量多。ISSR分子标记属于DNA分子标记技术中的一种，已经被证明是 分析基因多样性的一种高效、经济的方式，现已广泛用于种类鉴定和遗传关系分析。授权公 告号为CN103215365B的专利中公开了名称为一种陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法， 该方法按a、提取生鲜肉及其肉制品的总DNA; b、利用ISSR-PCR反应扩增生鲜肉及其肉制品 的DNA;c、构建生鲜肉及其肉制品的DNA电泳图谱;d、鉴定陆川猪及其肉制品的步骤进行，最 终绘制了 7张陆川猪及其肉制品的电泳图谱，建立了陆川猪及其肉制品的DNA指纹图谱，可 作为区分鉴定陆川猪及其肉制品的依据。同时，该专利中利用WM29引物可将陆川猪从己马 香猪中鉴别出来。但是，并没有针对己马香猪鉴定的方法，通过此引物也不能判断未知样品 是否为己马香猪。因此，建立一种针对己马香猪的准确的DNA鉴定方法，对保障己马香猪品 种纯正，规范己马香猪市场和推动己马香猪产业化进程有重要意义。
技术实现思路
专利技术人在研究中发现，采用ISSR分子标记鉴定己马香猪与其他猪品种时会出现W 下问题：一方面，在鉴定方法和样品个体差异的共同作用下，鉴定结果表现为个体差异较 大，包括同属于己马香猪运个品种的不同样品的个体差异也较大。运样，同属于己马香猪的 不同个体，无法聚集成一类，其相似系数较低，可能出现将己马香猪被错误鉴定为不是己马 香猪的问题。另一方面，可能出现己马香猪样品与其他猪品种之间差异不明显，运样就可能 出现将其他品种的猪错误地鉴定为己马香猪的结果。因此需要一种既能将己马香猪样品与 其他品种的猪样品显著区分，也能使己马香猪不同个体样品聚集成簇，且其相似系数较高 的ISSR分子标记鉴定方法。[000引本专利技术旨在解决己马香猪肉制品真伪难辨，缺乏准确且快速的鉴定方法及上述研 究过程中出现的问题，提供一种利用ISSR分子标记对己马香猪进行鉴定的方法，不但能够 快速、准确地将己马香猪、环江香猪、藏猪、己马本地上猪和成华猪区分开，还能准确地鉴定 未知样品是否为己马香猪，避免鉴定误差。为解决上述技术问题，本专利技术通过W下技术方案实现： 一种利用ISSR分子标记进行UPGMA聚类分析来鉴定己马香猪的方法。 所述利用ISSR分子标记鉴定己马香猪的方法，包括W下步骤： A. 样品DNA提取； B. PCR反应及产物检测； C. UPGMA聚类分析，与标准品的相似系数>0.94,即可鉴定样品为己马香猪。 所述步骤A中，样品DNA可按W下方法提取:称取生鲜猪肉样品0.5g，液氮研磨，然 后用DNA提取试剂盒进行DNA的提取。该DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司生产的血 液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit。 所述PCR反应中所用引物的核巧酸序列为5'-(ATG)6-3'。 所述PCR反应的体系为:模板DM 1.5 化、引物1 liL^XTaq PCRMaster Mix 12.5 化、(1地2〇补足至25 liLsPCR反应程序为：94°C预变性5 min,然后94°C变性45 s，51 °C退火 45 s，72°C延伸1.5 min,共35个循环，最后72°C总延伸7 min。所述PCR产物检ii方法为:用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测。[00叫所述的UPGMA聚类分析是ISSR电泳图成像后，利用Quantity化e软件对扩增片段 进行UPGM聚类分析。[001引有益效果： 1、为解决己马香猪肉制品真伪难辨，缺乏准确、有效的鉴定手段运一问题，本专利技术首次 提出了使用ISSR分子标记方法对己马香猪进行鉴别、鉴定的方法，在可靠、快速区分己马香 猪、环江香猪、藏猪、己马本地±猪和成华猪的基础上，经过实践，得出鉴定未知样品是否为 己马香猪的可靠相似性系数，从而将与己马香猪标准品相似系数大于或等于0.94的未知样 品鉴定为己马香猪。运为己马香猪鉴定提供依据，对保障己马香猪品种纯正，规范己马香猪 市场和推动己马香猪产业化进程有重要意义。 2、本专利技术将特定的样品DNA提取过程、PCR反应体系、PCR反应程序、产物检测方法 和UPGMA聚类分析等特定地、有效地结合，特别是核巧酸序列为5'-(ATG)6-3'的引物与PCR 反应体系的有效结合，使得本专利技术方法在鉴定己马香猪时表现出与其他品种的猪之间差异 性明显，而己马香猪不同个体间能聚集成簇，相似系数高达0.94的特点，从而能准确地将己 马香猪与其他品种的猪区分开，还能有效减小己马香猪之间因个体差异造成的鉴定误差。 与同类的，授权公告号为CN103215365B，需采用Ξ个自行设计的引物才能将陆川 猪与其他品种的猪区分开来的方法相比，本专利技术方法仅采用核巧酸序列为5'-(ATG)6-3'的 引物就能将己马香猪、环江香猪、藏猪、己马本地上猪和成华猪区分开，方法更简单，鉴别更 快速，大大地节省了鉴定时间。【附图说明】 图巧引物扩增出的五个品种猪肉的电泳图； 图2为ISSR分析中五种猪肉的UPGMA聚类分析图。【具体实施方式】下面通过具体实施例对本专利技术的技术方案作详细说明。[001引实施例1 一种利用ISSR分子标记进行UPGMA聚类分析来鉴定己马香猪的方法。 所述鉴定己马香猪的方法，包括W下步骤： A、 样品DNA提取； B、 PCR反应及产物检测； C、 UPGMA聚类分析，与标准品的相似系数>0.94,即可鉴定样品为己马香猪。 所述PCR反应中所用引物的核巧酸序列为5'-(ATG)6-3'。 实施例2 ISSR分子标记鉴定己马香猪、环江香猪、藏猪、己马本地±猪和成华猪。 称取需鉴定己马香猪、环江香猪、藏猪、己马本地±猪和成华猪生鲜猪肉样品 〇.5g，液氮研磨，按照DNA提取试剂盒的说明书提取DNAdDNA提取试剂盒为天根血液/细胞/ 组织基因组DNA提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit(DP304-02)。用0.8 %的琼脂糖凝胶 电泳检测提取到的DNA的完整性，并通过超微量蛋白核酸分析仪检测所提到的DNA质量W及 0〇26日恤和0D28(W浓度，测定DNA纯度0〇26日恤/〇〇28日恤。-20°(3保存备用。 PCR反应引物，其核巧酸序列为5'-(ATG)6-3'。采用该引物对ISSR进行扩增。PCR反 应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用ISSR分子标记进行UPGMA聚类分析来鉴定巴马香猪的方法。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙群，耿琦，李婉丽，金玉兰，李松，孙宏虎，温文婷，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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