本发明专利技术公开一种蚊虫快速鉴定DNA芯片及其鉴定方法，其特征在于所述方法采用ND2、COI和ITS2三个基因，设计专一性探针，通过DNA芯片上一系列的显色反应，肉眼即可对供试九种重要蚊虫进行种类鉴定。本发明专利技术提供的蚊虫快速鉴定芯片，可同时快速、准确地鉴定九种重要蚊虫，操作简单，在检验检疫和疾病预防控制等领域具有较好的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及物种鉴定领域，具体涉及九种重要蚊虫的分子鉴定方法。
技术介绍
蚊虫(mosquitoes)是"四害"之首，可传播黄热病、登革热等多种虫媒传染病。据报 道，2014年因蚊传疾病而死亡的人数约有72.5万人之多。蚊虫属昆虫纲（Insecta)双翅目 (Diptera)蚊科(Culicidae)，目前全世界记录约3500多种。据世界健康组织统计，一只蚊虫 可感染100多人。随着交通的日益便利化，蚊虫通过飞机、船舶等交通工具扩散至不同国家 或地区并引起虫媒传染病暴发流行的风险日益增大。因此，如何正确、快速鉴定蚊虫种类成 为疾病预防控制的重要工作。 传统上，可依靠蚊虫的形态学特征对其进行种类鉴定，但对于近缘种或姐妹种或 虫体受损或特征脱落的蚊虫等，都可能导致无法正确判别种类或者消耗过多时间而影响疾 病控制，因此一种可以准确、快速的蚊虫种类鉴别技术，将大大有助于防疫工作。 分子鉴定技术是以遗传物质DNA序列分析为依据来阐明物种间的差别，从分子水 平上快速而准确地鉴别物种。它是分子生物学、计算机科学与传统分类学相结合的产物，作 为一种崭新的分类学技术，极大弥补了传统形态学鉴定的缺陷，已引起越来越多生物学家 们的重视。近年来，随着以PCR基础的DNA序列测定方法的建立和广泛使用，核糖体DNA (rDNA)的内转录间隔区（ITS)和线粒体DNA(mtDNA)的细胞色素 C氧化酶亚基1(⑶I)和NADH dehydrogenase II (ND2)等基因逐渐受到重视，并在蚊种的分子鉴定中得到广泛应用。 DNA芯片是在分子生物学基础上发展起来的一种分子鉴定的技术，它综合了其他 分子鉴定方法，如随机扩增多态DNA(RAPD)，限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)等的优势。利用专一性的探针和PCR产物结合，通过一系列的显色反应快速的达到鉴 定物种。目前，对蚊种的鉴定大都集中在传统鉴定方法，分子鉴定方法也主要集中在少数几 种姐妹种的鉴定或者比较费时间，主要采用单一基因（如仅采用C0I或仅采用ITS2等），将三 种不同基因结合通过设计专一性的探针和PCR产物反应来鉴定的方法至今未见报道，本发 明提供了一种蚊虫快速鉴定DNA芯片及其鉴定方法，可用于同时鉴定九种重要蚊虫，操作简 单，应用前景良好。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供九种蚊虫的三对简并引物序列和九种蚊虫专一性探针序 列及其分子鉴定方法-DNA芯片技术。通过分子生物学方法获取九种蚊虫的三个特异基因： ND2、C0I和ITS2,并通过对九种蚊虫针对这三段基因设计出该蚊种专一性的探针与多重PCR 反应的产物结合，可实现对未知蚊种的快速鉴定。 为实现上述目的，本专利技术通过如下技术方案实现： 本专利技术所述的一种针对9种蚊虫三个特定基因(ND2、C0I、ITS2)的PCR引物，其特征在于 所述PCR引物序列分别为： ND2-F：5'-GGRGCWTGAATAGGWTTAGAAATTAAT-3' ND2-R: 5 '-AAAWGGYGGTAATCCTCCTAAWGA-3， COI-F: 5 '-CAACAYTTATTYTGATTYTTTGG-3 ' COI-R: 5，-YCCTAARAARTGTTGWGGRAA-3 ' ITS2-5·8S: 5 '-CGGYGGATCACTYGGCTC-3 ' ITS2-28S: 5 '-GTTRKTTTCTTTTCCTCCSC-3 '。 九种重要蚊虫分别为：埃及伊蚊（Aedes aegypti )、白纹伊蚊（Aedes albopictus)、骚扰阿蚊（Armigeressubalbatus)、致倦库蚊（Culex quinquefasciatus)、骚 扰库蚊（Culex molestus)、三带卩彖库蚊（Culex tritaeniorhynchus)、环带库蚊（Culex annulus)、中华按蚊(Anophelessinensis)和微小按蚊(Anopheles minimus) 本专利技术用于9种重要蚊虫快速鉴定芯片的专一性探针，其探针序列如下：所述Aae指埃及伊蚊，Aal指白纹伊蚊，Asu指骚扰阿蚊，Cqu指致倦库蚊，Cmo指骚扰库 蚊，Ctr指三带卩彖库蚊，Can指环带库蚊，Asi指中华按蚊，Ami指微小按蚊，Inc指DR. Chip DIY?试剂盒的系统内部对照，ND2和C0I为线粒体基因，ITS2为核基因。 本专利技术所述的蚊虫快速鉴定芯片，包括以上所述的九种蚊虫的专一性探针，其特 征在于所述九种蚊虫的专一性探针固定在N3芯片上。 本专利技术所述的蚊虫快速鉴定芯片快速鉴定九种重要蚊虫的方法，包括如下： 1) 从待测的蚊虫组织中分离提取DNA; 2) 以该DNA为模板，将上述的三对基因(ND2、C0I、ITS2)的PCR引物混合在一起进行多重 PCR反应扩增出相应的基因片段，在5端都有生物素标记的三对基因的引物分别为： ND2-F: 5 '-GGRGCWTGAATAGGWTTAGAAATTAAT-3 ' ND2-R: 5 '-AAAWGGYGGTAATCCTCCTAAWGA-3， C0I-F: 5 '-CAACAYTTATTYTGATTYTTTGG-3 ' C0I-R: 5，-YCCTAARAARTGTTGWGGRAA-3 ' ITS2-5·8S: 5 '-CGGYGGATCACTYGGCTC-3 ' ITS2-28S: 5 '-GTTRKTTTCTTTTCCTCCSC-3 '； 3)将步骤2)制得的PCR产物加入到已固定有以上所述的九种蚊虫的专一性探针的由台 湾晶宇生物科技实业股份有限公司生产的N3芯片;按DR.Chip DIY? Kit试剂盒的方法进行 反应，2 h后得到显色反应。若是九种蚊虫中的一种则芯片显色反应后会出现相应的矩阵探 针点，若不是九种蚊虫中的一种则芯片显色反应不会全部出现该蚊种专一性的探针点。 所述芯片中的九种蚊虫的每一种均是由在N3芯片角落上的四个阳性对照探针点 和自己专一性的四个探针点，ND2，C0I探针各一个，两个ITS2探针。其中，致倦库蚊和骚扰 库蚊由于C0I基因难以设计探针点，故其是由一个ND2探针点和三个ITS2探针点构成矩阵， 而中华按蚊和微小按蚊由于ND2基因难以设计合适的探针点，故其是由一个C0I探针点和三 个ITS2探针点构成矩阵。矩阵中左上:ND2,右上:C0I，左下：ITS2-1，右下：ITS2-2构成。 本专利技术所述的致倦库蚊和骚扰库蚊的专一性探针分别有7个，只有ITS2-个点可 以区分两者。若出现E1这个探针点即为致倦库蚊，若出现E3这个探针点即为骚扰库蚊;当未 知蚊虫不是所述九种蚊虫中的一种时，则A1这个点一定会出现，而完整矩阵的四个点不会 出现。 本专利技术所述的三对基因的PCR引物按ND2-F:ND2-R:⑶I-F:⑶I-R:ITS2-5.8S: ITS2-28S 体积比为 1:1:1:1:0.5:0.5 混合。 本专利技术上述九种重要蚊虫的专一性探针序列通过核酸固定仪固定在台湾晶宇生 物科技实业股份有限公司生产的N3芯片上，具体步骤如下： 1) 配制探针溶液，将合成后的九种重要蚊虫专一性探针与1〇〇μΜ的2x探针溶液缓冲液 以及双蒸水按体积比本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种针对9种蚊虫三个特定基因(ND2、COI、ITS2)的PCR引物，其特征在于所述PCR引物序列分别为：ND2‑F：5’‑GGRGCWTGAATAGGWTTAGAAATTAAT‑3’ND2‑R: 5’‑AAAWGGYGGTAATCCTCCTAAWGA‑3’COI‑F: 5’‑CAACAYTTATTYTGATTYTTTGG‑3’COI‑R: 5’‑YCCTAARAARTGTTGWGGRAA‑3’ITS2‑5.8S: 5’‑CGGYGGATCACTYGGCTC‑3’ITS2‑28S: 5’‑GTTRKTTTCTTTTCCTCCSC‑3’；九种重要蚊虫分别为：埃及伊蚊（Aedes aegypti）、白纹伊蚊（Aedes albopictus）、骚扰阿蚊（Armigeressubalbatus）、致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）、骚扰库蚊（Culex molestus）、三带喙库蚊（Culex tritaeniorhynchus）、环带库蚊（Culex annulus）、中华按蚊（Anophelessinensis）和微小按蚊（Anopheles minimus）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄恩炯，陈敏，杨美琼，高博，王皙，陈嬿后，
申请(专利权)人：福建国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：福建;35
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