一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法，属于电化学发光传感器领域。以三联吡啶钌为电化学发光信号源，利用金杂化炭黑插层还原石墨烯优良的生物兼容性和大的比表面积增加抗体的固载量。用纳米多孔银作为二抗标记物，根据对不同浓度的待测物的电化学发光信号强度的不同，实现对肝癌标志物甲胎蛋白的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法
本专利技术涉及一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法。具体涉及一种金杂化炭黑插层还原石墨烯作为基底材料，利用纳米多孔银优良的生物兼容性和大的比表面积来固载三联吡啶钌和检测抗体，制备了一种检测甲胎蛋白的电致化学发光免疫传感器，属于新型功能材料与生物传感检测

技术介绍
原发性肝癌(HepatocellularCarcinoma,HCC)是一种很常见的恶性肿瘤，发病率高，预后差。甲胎蛋白（α-fetoprotein,αFP或AFP）是唯一广泛应用于诊断HCC的肿瘤标志物，是非侵入性诊断方法中的重要指标。甲胎蛋白主要来自胚胎的肝细胞，但当肝细胞发生癌变时，会产生大量甲胎蛋白，而且随着病情恶化，甲胎蛋白在血清中的含量会急剧增加，因此对甲胎蛋白的早期诊断很重要。目前已有的甲胎蛋白的临床检测方法很多，如酶联免疫分析、放射免疫分析、化学发光免疫分析等。但是上述方法具有放射性污染，灵敏度低，检测周期长，步骤繁琐等缺点。为了克服以上传统分析方法的缺点，本专利技术设计了一种特异性强，灵敏度高，无放射性污染，操作快速简便的电致化学发光免疫分析方法。本专利技术将炭黑与石墨烯复合，得到了炭黑插层的还原石墨烯，解决了单独使用石墨烯片层容易团聚的问题并提高了传感平台的导电性。金溶胶用于进一步功能化炭黑插层的还原石墨烯，提高了传感器的电致化学发光性能。并采用去合金化的方法直接得到具有较大比表面积的纳米多孔银，用其固载三联吡啶钌和二抗，在检测甲胎蛋白抗原的过程中产生了逐步放大的电化学发光信号，有效地增强了电致化学发光免疫传感器的灵敏度。该方法具有成本低、灵敏度高、特异性好、检测快速等优点，而且制备过程较为简单，为目前有效检测甲胎蛋白提供了新途径。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是合成具有较大比表面积的炭黑插层还原石墨烯材料，其可固载大量的金溶胶，提高基底材料的导电性，增强传感器的灵敏度。本专利技术的目的之二是通过去合金化的方法得到表面具有负电荷的纳米多孔银，通过静电作用牢固结合三联吡啶钌，提高电致化学发光信号的稳定性。本专利技术的目的之三是利用金杂化炭黑插层还原石墨烯作为基底材料，纳米多孔银-三联吡啶钌为标记层，构建一种无酶、快速且超灵敏的夹心型电致化学发光免疫传感器。本专利技术的目的之四是将该夹心型电致化学发光免疫传感器应用于甲胎蛋白的快速、灵敏检测。本专利技术的技术方案如下：1.一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法（1）将直径为4mm的玻碳电极依次用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）将2~10μL、浓度为1~3mg/mL的甲胎蛋白抗体捕获基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液于电极表面，4℃保存；（3）用3~9μL、质量分数为0.5~1.5%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1~5h，清洗干净；（4）将2~6μL浓度为0.0001~30ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净；（5）将4~8μL浓度为1~3mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1h，清洗干净，于4℃冰箱中储存备用。2.甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备（1）炭黑插层还原石墨烯溶液的制备将25~75mg氧化石墨烯加入到25~75mL去离子水中，室温下超声2h，得到溶液A；称取2~300mg炭黑分散在8~120mL的N,N-二甲基甲酰胺中，室温下超声2h，得到溶液B；将1~100mL溶液A加入到1~100mL溶液B中，室温下超声分散2h，加入5~15μL、体积分数为80%的水合肼溶液，剧烈振荡5min，100℃下加热1~5h，5000~8000r/min下离心洗涤10~30min，制得炭黑插层还原石墨烯复合材料；（2）金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备将1~3mg炭黑插层还原石墨烯分散到1mL超纯水中，加入0.5~1.5mL金溶胶，得到的混合溶液在室温下振荡12~36h，5000~8000r/min下离心洗涤10~30min，制得金杂化炭黑插层还原石墨烯；将金杂化炭黑插层还原石墨烯重新分散于1mL超纯水中，得到基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液；（3）甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液的制备将1mL、浓度为1~3mg/mL的金杂化的炭黑插层还原石墨烯溶液与100~300μL、浓度为5~15μg/mL的甲胎蛋白捕获抗体混合，振荡12h，4000~6000r/min下离心洗涤10~20min，得到甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯孵化物，将其分散于1~3mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得甲胎蛋白抗体捕获基底材料—金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液。3.纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备（1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液的制备将0.1~10mg银铝合金放入20~500mL、浓度为0.5~1.5mol/L的氢氧化钠溶液中，室温下化学腐蚀12~36h，5000~8000r/min下离心洗涤4~8次，在真空干燥箱里干燥24~48h，制得纳米多孔银；将1~3mg的纳米多孔银分散到1~10mL超纯水中，加入1~5mL、浓度为0.5~1.5mmol/L的三联吡啶钌溶液，室温避光振荡12~36h，4000~8000r/min下离心洗涤3~9次，将产物重新分散到1mL超纯水中，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液；（2）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备将1mL、浓度为1~3mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液与100~500μL、浓度为5~15μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，振荡12~36h，4000~6000r/min下离心洗涤10~20min，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体孵化物，将其分散于1mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液。4.甲胎蛋白的检测方法（1）使用电化学工作站的三电极体系进行测试，Ag/AgCl电极作为参比电极，铂丝电极为对电极，所制备的电化学发光传感器为工作电极，将电化学工作站和化学发光检测仪连接在一起将光电倍增管的高压设置为600V，循环伏安扫描电位范围为-1.8~-0.6V，扫描速率为0.10V/s；（2）在10mL、pH5.5~8.0的含100~150mmol/L三乙醇胺的磷酸盐缓冲溶液中，通过电化学发光系统，检测对不同浓度的甲胎蛋白标准溶液产生的电化学发光信号强度，绘制工作曲线；（3）将待测样品溶液代替甲胎蛋白标准溶液进行检测。本专利技术的有益成果（1）本专利技术将炭黑与石墨烯复合，得到了炭黑插层的还原石墨烯，解决了单独使用石墨烯片层容易团聚的问题，提高了传感平台的导电性。金溶胶用于进一步功能化炭黑插层的还原石墨烯，提高了传感器的电致化学发光性能。（2）并采用去合金化的方法直接得到具有较大比表面积的纳米多孔银，用其固载三联吡啶钌和二抗，在检测甲胎蛋白抗原的过程中产生了逐步放大的电化学发光信号，有效地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将直径为4 mm的玻碳电极依次用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；（2）将2 ~ 10 μL、浓度为1 ~ 3 mg/mL的甲胎蛋白抗体捕获基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液于电极表面，4 ℃保存；（3）用3 ~ 9 μL、质量分数为0.5 ~ 1.5%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4 ℃冰箱中孵化1 ~ 5 h，清洗干净；（4）将2 ~ 6 μL浓度为0.0001 ~ 30 ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净；（5）将4 ~ 8 μL浓度为1 ~ 3 mg/mL的纳米多孔银‑三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液滴在电极上与抗原特异性识别，室温下孵化1 h，清洗干净，于4 ℃冰箱中储存备用。

【技术特征摘要】
1.一种基于金杂化炭黑插层还原石墨烯的甲胎蛋白电致化学发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备1）纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液的制备将0.1~10mg银铝合金放入20~500mL、浓度为0.5~1.5mol/L的氢氧化钠溶液中，室温下化学腐蚀12~36h，5000~8000r/min下离心洗涤4~8次，在真空干燥箱里干燥24~48h，制得纳米多孔银；将1~3mg的纳米多孔银分散到1~10mL超纯水中，加入1~5mL、浓度为0.5~1.5mmol/L的三联吡啶钌溶液，室温避光振荡12~36h，4000~8000r/min下离心洗涤3~9次，将产物重新分散到1mL超纯水中，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液；2）纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液的制备将1mL、浓度为1~3mg/mL的纳米多孔银-三联吡啶钌标记物溶液与100~500μL、浓度为5~15μg/mL甲胎蛋白检测抗体混合，振荡12~36h，4000~6000r/min下离心洗涤10~20min，得到纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体孵化物，将其分散于1mL、pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中，制得纳米多孔银-三联吡啶钌标记的甲胎蛋白抗体溶液；（2）电致化学发光免疫传感器的制备方法1）将直径为4mm的玻碳电极用1.0μm、0.3μm、0.05μm氧化铝抛光粉依次做抛光处理，用超纯水冲洗干净；2）将2~10μL、浓度为1~3mg/mL的甲胎蛋白抗体捕获基底材料金杂化炭黑插层还原石墨烯溶液于电极表面，4℃保存；3）用3~9μL、质量分数为0.5~1.5%的牛血清白蛋白溶液封闭非特异性活性位点，于4℃冰箱中孵化1~5h，清洗干净；4）将2~6μL浓度为0.0001~30ng/mL的一系列不同浓度的甲胎蛋白用于捕获抗体的特异性识别，室温下孵化1h，清洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏琴，朱文娟，吴丹，范大伟，孙旭，胡丽华，马洪敏，张勇，庞雪辉，杜斌，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东;37