本发明专利技术涉及一种采用LRS获取白细胞的方法及所获得白细胞在基础实验中的应用，该方法采用灭菌冲洗液、灭菌等渗液和灭菌冲洗液依序多次冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置，然后将各冲洗液回收后采用D-Hank’s液稀释并用Ficoll密度梯度离心法梯度分离，将所得白细胞粗品采用PBS缓冲液多次洗涤离心得到存活的大量白细胞。该方法在血小板单采结束后就可以处理白细胞滤器来避免白细胞减少，且操作简单省时、白细胞收集率高，为珍贵的白细胞资源回收利用又提供了一条简便的途径，此外所得的白细胞可直接替代直接自外周血分离所得的白细胞在免疫学、药理学、肿瘤学和血液学中的应用，在不影响临床供血的前提下，稳定可靠的建立了获得白细胞的新途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种外周血白细胞的获得方法和所获得白细胞的应用，尤其涉及一种外周血单个核细胞的获得方法和所获得的外周血单个核细胞在基础实验中的应用。
技术介绍
人外周血白细胞是基础实验常需的资源，尤其在免疫学、药理学、肿瘤学研究以及血液学实验研究中，健康人白细胞包括T淋巴细胞，B淋巴细胞，NK和单核细胞的需求特别大，特别是一系列基础实验如T细胞功能调节、Th细胞分化、移植排斥的混合淋巴反应等实验均需要健康人外周血白细胞;此外在一些实验动物构建和肿瘤免疫治疗中需要的白细胞特别是T细胞数量也特别巨大。原本这些实验均需要中心血站或者志愿者反复无偿献血提供全血，然而近年来临床血液供应都存在困难的情况下，通过原来的实验用血来源途径满足基础实验需求已经不现实，因此寻找一个新的方法代替传统的途径是当下之急。最近，有研究者从全血白细胞滤器获得了大量的白细胞，并且证实这些白细胞在活力和功能方面都能应用于基础实验研究。如Meyer等发现从全血白细胞滤器获得大量外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，并且经过一系列体外实验证实:所获PBMC很好的包含了各种细胞种类，并且各类细胞亚群的比例与正常人外周血相当，这些细胞可作为实验细胞的一个新的来源。而Ivanovic等证实从滤器中还可获得大量CD34+细胞，并发现这些细胞与来源于外周血的CD34+细胞在功能方面不存在显著性差异。再如Ebner等人发现，滤器中所获得的CD14+前体细胞可在体外条件下诱导分化为用于免疫治疗的树突状细胞。但是从全血白细胞滤器中获取PBMC存在一个问题，即全血采集数小时至十数小时后才进行白细胞过滤，这时再处理滤器，白细胞的获取量将减少。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种采用LRS获取白细胞的方法及所获得白细胞在基础实验中的应用，该获得白细胞的方法实验设备要求低、操作简单省时、白细胞的收集率高、纯度高，且所获得白细胞可直接替代人外周血所获得的白细胞，为白细胞的资源回收利用提供了一条简便高效的途径。本专利技术的技术方案是:—种采用LRS获取白细胞的方法，该方式是对经血小板单采术后的单采血小板白细胞滤器在百级洁净区内进行包括如下步骤所述的操作:(1)使用D-Hank，s液冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置3?4次，去除白细胞过滤装置上附着的血渍并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；(2)继续使用D-Hank，s液冲洗经(1)处理后的单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置2?3次，每次30?35s，去除白细胞过滤装置上粘附的物质并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；(3)再次使用D-Hank ’ s液冲洗经(2)处理后的单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置2?3次，将粘附其上的白细胞冲洗脱落，并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；(4)将(1)、(2)和(3)中收集到的冲洗后所得的冲洗液混合形成混合液并转移至无菌离心管中，采用D-Hank，s液将上述混合液进行稀释，其中混合液与D-Hank，s液的质量比为1:18?20;然后采用Ficoll密度梯度离心法按照1:2进行梯度分离，其中离心速率为1800?1900rpm，离心温度为37?37.5°C，离心时间为30?35min，离心过程结束后得到离心液体；(5)用吸管吸取(4)中得到的离心液体的中间白膜层，得到白细胞粗品，然后采用PBS缓冲液对该白细胞粗品进行洗涤，并采用常温下1200?1300rpm的转速离心5?6min后，弃去上清液，得到沉淀物;将该沉淀物再次使用PBS缓冲液进行洗涤离心后，得到的最终沉淀物为存活的白细胞。其进一步的技术方案是:其中D-Hank’s液可以采用本领域常规组成比例进行配制，也可以按照下述方法进行配制:8g氯化钾(KCl)、3.04g磷酸二氢钠(Na2HP04.12H20)、1.2g磷酸二氢钾(ΚΗ2Ρ〇4)、20.0g葡萄糖和0.1Ν氢氧化钠(NaOH)加入瓶中，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入5.6 %NaHC03调pH至7.2?7.6，最后定容到1L，高温灭菌。其中PBS缓冲液可以采用本领域常规组成比例进行配制，也可以按照下述方法进行配制:将2.0g磷酸二氢钾(KH2P04)、1.42g磷酸二氢钠(NaH2P04)、8g氯化钠(NaCl)和0.2g氯化钾(KC1)加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，尚温灭囷。本专利技术还公开了一种含有上述所述方法获得的存活的白细胞的试剂盒。本专利技术还公开了通过上述所述方法获得的白细胞在免疫学、药理学、肿瘤学和血液学中的应用。其进一步包括:采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞在过继免疫治疗细胞中的应用。采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞的过继免疫治疗细胞在共刺激分子的表达中的应用。采用单采血小板白细胞滤器获取的白细胞在T细胞增殖和经扩增后细胞因子分泌检测中的应用。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点:本专利技术公开了一种单采血小板白细胞滤器获取白细胞的方法，该方法使用灭菌冲洗液和灭菌等渗液冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置，其无需使用灭菌高渗液对装置进行浸没静置处理，只需用等渗溶液清洗并收集白细胞，然后分离收集获得存活白细胞。本专利技术方法在血小板单采结束后就可以处理白细胞滤器，避免白细胞的减少，且操作简单，实验设备要求低，操作时间短，且白细胞收集率高，为珍贵的白细胞资源回收利用又提供了一条简便的途径，此外所得的白细胞可直接替代直接自外周血分离所得的白细胞在免疫学、药理学、肿瘤学和血液学中的应用，在不影响临床供血的前提下，可靠并稳定的建立了获得白细胞的新途径。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。【附图说明】图1是采用溶血法对初始状态的细胞亚群分型分析图；图2是PBMC体外分离纯化⑶3+T细胞的纯度结果分析图；图3是体外扩增的PBMC形态的电镜图；图4是采用台盼蓝染色法测出的过继免疫细胞增殖速率动态比较图；图5是采用CCK8检测出的过继免疫细胞增殖速率动态图；图6是采用CFSE荧光标记检测出的过继免疫细胞增殖速率比较图；图7是培养第10天的过继免疫细胞中⑶3+⑶4+T和⑶3+⑶8+T细胞群体的变化情况分析图；图8是培养第10天的过继免疫细胞的正性共刺激分子分布比例的比较分析图；图9是培养第10天的过继免疫细胞的负性共刺激分子分布比例的比较分析图；图10是培养第10天的过继免疫细胞的正负性共刺激分子在CD4+和CD8+细胞中的比例分布分析图。【具体实施方式】下面结合附图和实施例，对本专利技术的【具体实施方式】作进一步详细描述，以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本专利技术中具体实施例的实验结果均采用graphpad 5.0统计软件，计量资料以x 土 s表示，计数资料以比率(P)表示，X2检验，以P〈0.05表示差异有统计学意义。本专利技术具体实施例中所使用的主要试剂有:抗人CD3单克隆抗体(0KT-3)、IL-2为市售；CD4-FITC、CD8_PE、CD8_PE_CY5，CD3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用LRS获取白细胞的方法，其特征在于：对经血小板单采术后的单采血小板白细胞滤器在百级洁净区内进行包括如下步骤所述的操作：(1)使用D‑Hank’s液冲洗单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置3～4次，去除白细胞过滤装置上附着的血渍并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；(2)继续使用D‑Hank’s液冲洗经(1)处理后的单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置2～3次，每次30～35s，去除白细胞过滤装置上粘附的物质并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；(3)再次使用D‑Hank’s液冲洗经(2)处理后的单采血小板白细胞滤器上的白细胞过滤装置2～3次，将粘附其上的白细胞冲洗脱落，并将每次冲洗后所得的冲洗液收集在一起；(4)将(1)、(2)和(3)中收集到的冲洗后所得的冲洗液混合形成混合液并转移至无菌离心管中，采用D‑Hank’s液将上述混合液进行稀释，其中混合液与D‑Hank’s液的质量比为1:18～20；然后采用Ficoll密度梯度离心法按照1:2进行梯度分离，其中离心速率为1800～1900rpm，离心温度为37～37.5℃，离心时间为30～35min，离心过程结束后得到离心液体；(5)用吸管吸取(4)中得到的离心液体的中间白膜层，得到白细胞粗品，然后采用PBS缓冲液对该白细胞粗品进行洗涤，并采用常温下1200～1300rpm的转速离心5～6min后，弃去上清液，得到沉淀物；将该沉淀物再次使用PBS缓冲液进行洗涤离心后，得到的最终沉淀物为存活的白细胞。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王明元，古彦铮，汤龙海，张光波，徐军，周群刚，
申请(专利权)人：苏州市中心血站，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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