本发明专利技术提供一种基于鸟嘌呤的超猝灭分子信标的构建及应用。具体地，本发明专利技术利用G碱基和有机猝灭基团对某些有机荧光基团的双重猝灭作用，发明专利技术了一种结构简单、合成容易、稳定性好、与目标物反应速度快的超猝灭分子信标，提供了一种利用上述超猝灭分子信标定量检测目标分子的方法，利用上述超分子信标建立了一种病毒检测的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物及分析化学
，具体涉及利用有机猝灭基团及鸟嘌呤的双 猝灭作用构建一种超猝灭分子信标传感器及其应用。
技术介绍
分子信标(molecular beacons)是一种呈发夹结构的莖-环双标记的寡核苷酸探 针。经典分子信标由Tyagi于1996年首次专利技术，由茎、环、有机荧光基团及有机猝灭基团四部 分构成。自1996年Tyagi首次将分子信标用于核酸检测以来，许多科研工作者在经典分子信 标的基础上合成了不同类别的分子信标。分子信标具有操作简单、选择性好以及不必与未 反应的探针分离即可实时检测等优点，现已广泛应用于聚合酶链反应(PCR)的实时监测，基 因突变的快速分析，核酸及蛋白质检测，细菌及病毒分析，酶降解监测以及核酸-蛋白质的 相互作用研究等方面。 尽管分子信标在各个领域中都获得了较为成功的应用，但现有的分子信标在对实 际样品的定量分析中，荧光背景与其结构之间存在着较为突出的矛盾。经典分子信标结构 简单、合成容易，但存在较高的荧光背景，而荧光背景的存在严重地影响其在定量分析中的 灵敏度及定量限。为了解决经典分子信标存在较高荧光背景的问题，许多科研工作者通过 改变经典分子信标中的猝灭基团来降低其荧光背景。例如Maxwell和Mao等用金纳米粒子作 为荧光猝灭剂替代经典分子信标中的猝灭基团，设计了新型分子信标。在该分子信标中，金 纳米粒子对荧光基团羧基荧光素(FAM)的平均猝灭效率达到98.68%; Yang等通过用多个猝 灭基团组装成一个猝灭分子阵列同时对一个荧光基团进行猝灭，构建了超猝灭分子信标。 他们用3个4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸(DABCYL)分子组成的分子阵列对FAM的平均猝灭效率可 达99.5% ;Lu等利用氧化石墨烯替代分子信标中的有机猝灭基团，显著降低了分子信标的 荧光背景，得到很高的信噪比。这些改进的分子信标虽然显著地降低了荧光背景，但是结构 复杂，而复杂的结构又带来了新的问题。一是有的分子信标制备过程非常复杂，制备时间 长;二是有的分子信标自身稳定性相对较差，检测结果的重复性不好;三是有的分子信标中 由于有较大粒径的纳米粒子的存在，空间位阻大，与目标物反应速度慢。 理论上讲，一个理想的分子信标应满足以下几个条件：（1)荧光背景低；（2)稳定性 好且结构简单，制备过程容易；（3)与目标物反应速度快。但目前所报道的分子信标都很难 同时满足以上条件。 鸟嘌呤(G碱基)对很多有机荧光染料具有很好的猝灭作用。其基本原理为G碱基在 荧光共振能量转移中可作为荧光能量受体，许多有机荧光染料的荧光可以通过光诱导电子 转移的方式被其猝灭。例如Torimura等利用核酸杂交实验研究了G碱基对有机荧光基团的 猝灭效果，结果表明G碱基对FAM的猝灭效率可达到86%，对羧基四甲基罗丹明（TAMRA)的猝 灭效率可达89%。本专利技术人利用G碱基对FAM及TAMRA的猝灭作用设计了一种复合分子信标， 结果表明G碱基对FAM的猝灭效率可达到82.3%，对TAMRA的猝灭效率可达81.6%。这充分说 明G碱基对FAM及TAMRA确实具有很好的猝灭效果。 针对现有分子信标在定量分析中存在的问题，结合G碱基对某些荧光基团的猝灭 作用，本专利技术人利用G碱基和有机猝灭基团对某些有机荧光基团的双重猝灭作用，专利技术了一 种结构简单、合成容易、稳定性好、与目标物反应速度快的超猝灭分子信标，并对所专利技术的 超猝灭分子信标进行了应用。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对现有分子信标的局限性，提供一种结构简单、合成容易、稳 定性好的超猝灭分子信标，并将其应用到核酸及病毒的检测中。 本专利技术的第一方面，在于提供了一种基于G碱基和有机猝灭基团的双重猝灭作用 所构建的超猝灭分子信标探针（图1)。超猝灭分子信标探针5 '端标记能被G碱基和有机猝灭 基团进行双重猝灭的荧光基团，3'端标记猝灭基团；探针环的部分为13-45个碱基，能与靶 标分子发生特异性反应。探针在游离状态下形成茎-环的发卡结构，荧光基团与有机猝灭基 团和G碱基相互靠近，荧光基团的荧光被有机猝灭基团和G碱基猝灭，当探针与目标分子结 合时，茎-环结构被破坏，荧光基团远离有机猝灭基团和G碱基，荧光基团的荧光恢复。其检 测原理如图1所示。 优选地，所述超猝灭分子信标茎干区含4-8个碱基的核苷酸片段。更优选地，上述 超猝灭分子信标探针5'端茎部序列为5'-CCC GCG-3'，3'端茎部序列为5'-CGC GGG-3'。 优选地，所述超猝灭分子信标的结构具体为荧光基因_(CH2)n_CCC GCG环状区 C GCG GG-(CH2)m-有机猝灭基团-3'，其中，m、n为小于12的任选自然数。 优选地，所述荧光基团既能被G碱基所猝灭，又能被常见的有机猝灭基团所猝灭 (如FAM，TAMRA，R0X及CY5等）。更优选地，所述荧光基团为FAM或TAMRA。 优选地，所述猝灭基团能猝灭分子信标探针5'端标记的荧光基团（如BHQ-1，BHQ-2，DABCYL等）。更优选地，所述猝灭基团为BHQ-1或BHQ-2。 本专利技术的第二方面，在于提供了一种利用上述超分子信标定量检测目标分子的方 法。所述方法包括如下步骤:将目标分子加入到一定浓度的超猝灭分子信标中，在一定的温 度下孵育一段时间后，再对体系的荧光值进行检测。根据荧光值的大小，对比标准溶液的荧 光值，即可得到目标核酸的浓度。 优选地，所述目标分子包括核酸和蛋白质分子。 本专利技术的第三方面，在于提供了一种利用上述超猝灭分子信标检测病毒的方法。 所述方法包括如下步骤:先通过不对称聚合酶链式反应(不对称PCR)获得含目标DNA的单链 核酸，再在该体系中加入超猝灭分子信标，在一定的温度下孵育一段时间后，最后对体系的 荧光值进行检测。病毒的定量分析步骤为:先将已知病毒拷贝数的病人血清用正常人血清 配制成一系列含不同拷贝数的样品，分别进行不对称PCR，然后在扩增的样品中分别加入超 猝灭分子信标，反应后分别对各体系的荧光进行检测。 本专利技术的有益效果为： (1)超猝灭分子信标探针设计:现有的分子信标中，结构简单、合成容易的分子信 标存在较高的荧光背景;而荧光背景低的分子信标结构复杂，制备时间长，自身稳定性相对 较差，空间位阻大，与目标物反应速度慢。本专利技术的超猝灭分子信标在设计时，将茎部与猝 灭基团相连接的核苷酸上的碱基设计为G碱基，利用有机猝灭基团及G碱基的双重猝灭作 用，构建超猝灭分子信标。这种超猝灭分子信标既保持了经典分子信标的简单结构，又显著 地降低了其荧光背景(图2)。 (2)采用本专利技术基于有机猝灭基团及G碱基的双重猝灭作用所构建的超猝灭分子 信标，大大提高了目标分子(核酸，蛋白质)检测的准确度和灵敏度，具有合成容易、检测速 度快、检测成本低等特点。 (3)本专利技术中的超猝灭分子信标，改变分子信标中环的排列顺序，可实现对多种不 同目标分子的检测。不仅可对核酸进行检测，还可对蛋白质等分子进行检测。同时改变分子 信标中的荧光基团，猝灭基团和环的结构，设计出不同的分子信标，还可实现对多种不同的 目标分子的同时检测。 (4)采用本专利技术所构建的超猝灭分子信标，结合PCR，可实现对病毒的检测。【附图说明】图1:本专利技术检测原理图 图2:有无 G本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于鸟嘌呤的超猝灭分子信标，包括依次排布的荧光基团、分子信标茎干区、环状区和有机猝灭基团，所述环状区为与靶标分子特异结合的核苷酸片段，所述分子信标茎干区为分子信标双链部分。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：向东山，翟琨，田从魁，史伯安，赵黎明，
申请(专利权)人：湖北民族学院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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