一种脂肪体的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种脂肪体的制备方法及其应用。本发明专利技术所提供的一种制备由中性脂质和单层磷脂膜组成的脂肪体的方法，包括下述步骤：a1)将磷脂和中性脂质在缓冲液中进行涡旋以实现两者的反应，然后进行离心，收集上层液相；a2)将步骤a1)得到的上层液相进行两次以上的纯化；每次纯化的方法为：将上层液相与所述缓冲液混匀，然后使其分层，收集上层液相；a3)将步骤a2)得到的上层液相与所述缓冲液混合，然后使其分层，收集下层液相，其中含有脂肪体。利用本发明专利技术提供的方法制备的脂肪体，可招募一种或几种固有蛋白和/或功能蛋白、获得人工脂滴，可招募一种或几种载脂蛋白、获得人工脂蛋白，均在制备药物和/或药物载体中具有重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及。
技术介绍
脂滴（lipid dr〇plet，LD)是一种细胞器，它由中性脂质核心，单层磷脂膜与相关 蛋白组成，这一细胞器的功能包括：1)脂质的合成，存储，代谢和运输;2)蛋白质的存储和降 解;3)脂质信号分子和激素的生产和修饰;4)与其他细胞器的相互作用。由于脂滴具有上述 的多种功能，许多人类的疾病，特别是代谢性疾病，与脂滴的形成和动态变化息息相关，然 而，脂滴的形成机制和动态变化研究依然困难重重。目前仍然缺乏对脂滴如何形成、脂滴的 功能及调控机制的全面了解。脂滴的组成的复杂性及其与其它细胞器的相互作用干扰了我 们解构这些机制的能力。 在过去的十年中，人们致力于脂滴的分离纯化，并通过蛋白质组和脂质组研究阐 明脂滴的蛋白质和脂质组成。可是蛋白质组和其他的组分研究发现，分离得到的脂滴几乎 总是含有内质网、线粒体和其它细胞器的碎片。可见，制备结构和组成上都接近天然脂滴的 人工脂滴(Artificial Lipid Droplets，ALDs)是非常必要的。 除脂滴以外，人体内还有一类由单层磷脂膜包裹中性脂，表面覆有蛋白的结构，称 为脂蛋白（lipoprotein)。虽然脂蛋白与脂滴的结构非常类似，但二者定位不同，表面蛋白 不同：脂滴存在于细胞中，而脂蛋白存在于血液中；脂滴上的主要蛋白为脂滴固有/结构蛋 白（lipid droplet resident/structural protein)，而脂蛋白上的主要蛋白为载脂蛋白 (apolipoprotein)。不同的脂蛋白表面有不同的载脂蛋白。脂蛋白的种类和比例对人体健 康有着非常重要的影响。高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL)是胆固醇逆向运 输(cholesterol reverse transport)的关键组分，可防止胆固醇在血管壁上的沉积，对动 脉粥样硬化等心脑血管疾病有非常重要的预防作用。人工脂蛋白或可用于高密度脂蛋白的 补充制剂或其他药物载体。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题是提供药物载体及一种体外研究脂滴的体系。 为解决上述问题，本专利技术首先提供了一种脂肪体的制备方法，所述脂肪体由中性 脂质和单层磷脂膜组成。 本专利技术所提供的制备脂肪体的方法，包括下述步骤： al)将磷脂和中性脂质在缓冲液中进行涡旋以实现两者的反应，然后进行离心，收 集上层液相，从上层液相中分离得到脂肪体。 所述"从上层液相中分离得到脂肪体"可包括如下步骤： a2)将所述上层液相进行两次以上的纯化;每次纯化的方法可为:将上层液相与所 述缓冲液混匀，然后使其分层，收集上层液相； a3)将步骤a2)得到的上层液相与所述缓冲液混合，然后使其分层，收集下层液相， 其中含有脂肪体。所述缓冲液可为缓冲液B。 所述缓冲液B的溶质及其在缓冲液中浓度可为：15mM~25mM HEPES，80mM~120mM KC1，1.5~2.5mM的MgCh;溶剂可为去离子水;pH可为7.2~7.6。 所述缓冲液B的溶质及其在缓冲液中浓度具体可为：20mM HEPES，100mM KCl，2mM 的MgCh;溶剂具体可为去离子水;pH具体可为7.4。所述步骤al)中，所述涡旋的参数可为:总时长为3~5min; 所述步骤al)中，所述离心的参数可为：18000~22000g、3~7min。 所述步骤al)中，所述涡旋的参数具体可为:总时长4min。 所述步骤al)中，所述离心的参数具体可为:20000g、5min。 所述步骤a2)中，所述"上层液相进行两次以上的纯化"中的次数以上层液相与所 述缓冲液混匀，分层后无沉淀为准。 所述步骤a2)中，所述"使其分层"是通过离心实现的，所述离心的参数可为：18000 ~22000g、3~7min。 所述步骤a2)中，所述"使其分层"是通过离心实现的，所述离心的参数具体可为： 20000g、5min〇 所述步骤a3)中，所述"使其分层"是通过离心实现的，所述离心的参数可为:800~ 1200g、3~7min。 所述步骤a3)中，所述"使其分层"是通过离心实现的，所述离心的参数具体可为： 1000g、5min〇 所述磷脂为bl)、b2)或b3): bl)l，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(D0PC); b2)l，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(D0PC)和1，2_二-(9Z-十八 碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE); b3)l，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(D0PC)和1，2-二-十八碳烷 酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)。所述中性脂质为cl)或c2): cl)甘油三酯； c2)胆固醇油酸酯（cholesteryl oleate，C0)和甘油三酯。 所述b2)中，1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二-(9Z-十 八碳烯酰基)-sn-甘油-3磷酸乙醇胺的质量比可为1:0.01~2; 所述b3)中，1，2_二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2_二-十八碳 烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的质量比可为1:0.01~2;所述c2)中，甘油三酯和胆固醇油酸酯的质量比可为1~5:1。 所述b2)中，1，2-二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸胆碱和1，2-二-(9Z-十 八碳烯酰基)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺的质量比具体可为2:1、1:1或1:2; 所述b3)中，1，2_二-(9Z-十八碳烯酰基)-sn_甘油-3-磷酸胆碱和1，2_二-十八碳 烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱的质量比具体可为2:1、1:1或1:2; 所述c2)中，甘油三酯和胆固醇油酸酯的质量比具体可为5:1、4:1、3:1或2:1。 所述甘油三酯（triacylglycerol，TAG)的制备方法可如下：（1)取死亡的SD大鼠1 只，取皮下脂肪与大网膜脂肪，剪碎；（2)将步骤（1)得到的碎组织置于离心管中，加入萃脂 液甲（氯仿:去离子水=1:1，v/V)，剧烈涡旋1分钟，然后8000g离心10分钟；（3)取步骤(2)得 到的下层有机相，置于新的离心管中，如果发现其浑浊的话按照步骤(2)中的萃取方法进行 重复萃取直至其澄清；（4)取步骤(3)得到的下层有机相，在高纯氮下吹干(若吹干过程中发 现其变浑浊的话则按照步骤(2)中的萃取方法进行重复萃取）；（5)取步骤(4)得到的下层有 机相，在高纯氮下吹干(连续3次称重质量不变），产物即为甘油三酯。 所述甘油三酯可为甘油三油酸酯（tri〇lein，T0)。所述甘油三油酸酯（triolein,T0)具体可为Sigma公司的产品，产品目录号为 92860。 所述磷脂和所述中性脂质的质量比可为(dl)至(d6)中的任一种： (dl)0.25~3:5; (d2)3:5； (d3)2:5； (d4)l:5； (d5)l:10； (d6)l:20〇 利用上述脂肪体的制备方法制备的脂肪体也属于本专利技术的保护范围。 本专利技术还提供了一种制备人工脂滴的方法。 本专利技术所提供的制备人工脂滴的方法，包括在通过上述任一所述脂肪体的制备方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备由中性脂质和单层磷脂膜组成的脂肪体的方法，包括下述步骤：a1)将磷脂和中性脂质在缓冲液中进行涡旋以实现两者的反应，然后进行离心，收集上层液相，从上层液相中分离得到脂肪体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘平生，汪洋，周晓明，马学婧，
申请(专利权)人：中国科学院生物物理研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11