一种与致病力相关的灰霉病菌基因BcAls1及其应用属微生物基因工程技术领域，本发明专利技术提供的来自灰霉病菌的控制致病性的基因BcAls1，其DNA序列如SEQ ID No:1所示，由1918个核苷酸组成；提供的BcAls1基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示，由616个氨基酸组成；BcAls1基因可在植物抗灰霉病基因工程领域中应用；通过对灰霉病菌控制致病性的蛋白质BcAls1进行缺失、突变或修饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属微生物基因工程
，具体涉及植物保护领域中控制真菌致病性的 基因及其编码蛋白质的应用。
技术介绍
灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又称作灰葡萄孢，属于子囊菌门（Ascomycota) 真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多种植物，包括几乎所有的蔬菜及果树。寄主从苗期、 挂果期到贮存期均可发病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，叶部发病的典型症状表 现为"V"形病斑，花部主要表现为腐烂和调萎，果实主要表现为腐烂和脱落。病害的发生和 蔓延与环境的湿度、温度存在密切的关系，在20°C_23°C，相对湿度90%以上时发生严重。因 此，灰霉病属低温高湿型病害，在多雨季节或者保护地生产中极易发生，世界上每年因该病 导致的经济损失高达100-1000亿美元。由于寄主范围广泛，生产上危害严重，再加上相关分 子研究技术成熟，灰霉病菌已成为最重要的模式植物病原真菌之一，受到广泛研究。 灰霉病菌是典型的死体营养型病原真菌，可生成多种致病因子参与致病，主要包 括细胞壁降解酶类、角质酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反应的酶类、小RNA及小分子物质等， 这些因子相互协作使灰霉病菌能够杀死寄主细胞，并分解死亡的寄主组织作为营养。自然 条件下，灰霉菌多以分生孢子作为侵染寄主的初侵染和再侵染来源。灰霉病菌常以菌丝体、 分生孢子或菌核附着在植物病残体上，或在土壤中越冬和越夏，成为下一生长季的初侵染 来源。当条件适宜时，菌核萌发产生菌丝体和分生孢子梗，并产生大量的分生孢子。成熟的 分生孢子能够借助风、雨水、灌概水和农事操作等进行传播。在低温高湿条件下，分生孢子 萌发形成芽管，芽管末端稍稍膨大发育成附着胞或者进一步形成侵染垫等侵染结构，主要 从衰败的花器、伤口以及坏死组织侵入。 当高浓度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主时，发病迅速，此时主要通过芽管顶端形 成的附着胞侵入;伴随孢子浓度降低，通过芽管顶端侵入的比例降低，发病速度也相应延缓 1-4天，此时主要通过由菌丝发育成的附着胞或侵染垫侵入。灰霉病菌侵入寄主细胞后，将 会直接面临寄主组织内敌对环境的挑战，病原菌必须迅速做出调整，一方面抑制植物的防 御反应，另一方面要积极适应寄主细胞内物理、化学环境，做到这两方面，灰霉病菌才有望 成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通过改变自身的代谢途径，并分泌相关效应因 子(如毒素)来实现上述目标的，但参与相应过程的基因、蛋白及代谢产物及其调控的分子 机制仍所知甚少。对该领域进行深入研究，鉴定灰霉病菌用以适应寄主内环境的关键因子， 不仅有助于揭示灰霉病菌这种死体营养型病原真菌致病的分子机制，还有可能从中发现可 以作为杀真菌剂作用靶标的蛋白质，为开发防治灰霉病及其它类似病害的高效药剂奠定理 论和技术基础。 Alsl是一种氨基酮戊酸合成酶，参与催化血红素合成途径的第一步反应。该蛋白 广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等生物，由于血红素可以作为众多蛋白的辅基参与多种 生命过程，因此，作为催化血红素合成酶类之一的Alsl蛋白质具有重要的功能。Alsl蛋白质 在灰霉病菌中同样存在，而且功能尚未获得鉴定，通过分析灰霉病菌A1 s 1编码基因的致病 功能，评价该基因在灰霉病菌发育及致病过程的作用，有利于鉴定潜在的防治靶标，用于筛 选新型杀真菌药剂。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提供一种控制致病性的基因及其编码的蛋白质。 本专利技术所提供的控制致病性基因来源于灰霉病菌，名称为BcAlsl，其DNA序列如 SEQ ID No:l所示。该DNA序列为BcAlsl基因开放阅读框，由1918个核苷酸组成，其中包含2 个外显子，分别位于SEQ ID No: 1的5'端第1位至337位核苷酸之间和第405位至1918位核苷 酸之间，组成的编码区长度合计为1851个核苷酸。 本专利技术提供了BcAlsl基因所编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，该 序列由616个氨基酸组成。 来自灰霉病菌的控制致病性基因 BcAlsl可应用于植物抗灰霉病基因工程领域。 对来自灰霉病菌的控制致病性基因 BcAlsl所编码的蛋白质进行缺失、突变或修 饰，而使其致病力发生缺陷，可作为靶标在设计和筛选抗真菌药剂中应用。本专利技术证明了BcAlsl基因的缺失或突变，导致灰霉病菌致病力显著降低，说明 BcAlsl基因是灰霉病菌引起农作物灰霉病所必需的基因。因此，筛选能够阻止该基因表达 与其蛋白质的表达、修饰及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的发生，从而有助于开发新 型杀菌剂，即本专利技术所提供的BcAlsl基因的一个重要用途是:该基因的表达与其编码的蛋 白质产物的表达、修饰及定位，可以作为重要候选靶标位点，用于抗真菌药剂(特别是抗灰 霉病菌药剂)的设计和筛选。【附图说明】 图1为BcAls 1蛋白质的结构域分析示意图 其中：5-aminolevulinate synthase为氨基酮戊酸合成酶结构域； 图2为灰霉病菌BcAlsl基因的敲除策略(通过同源重组进行基因替换)示意图 其中：WT为野生型菌株B05.10，pAlsl-ko为敲除载体，BcAlsl-KO为BcAlsl基因缺 失突变体；图3为BcAlsl基因缺失突变体及遗传互补菌株的PCR验证电泳图 其中：a、b、c、d为所用引物，相应位置见图2;M1为BcAlsl基因缺失突变体;Ml/Alsl 为在突变体Ml基础上转入完整BcAlsl基因的互补菌株； 图4为BcAlsl基因的突变体与野生型菌株的致病力比较照片 其中：所选择寄主为番茄，采用离体叶片接种菌饼的方法，接种3天后进行评价； Ml、M2为两株独立获得的BcAlsl基因缺失突变体； 图5为BcAlsl基因的突变体与对照菌株侵染寄主所产生病斑大小的定量分析示意 图 其中：接种方法同上，接种3天后对叶片病斑面积进行测量计算，换算成相对大 小。**表示在ρ〈0·01水平上差异显著。【具体实施方式】为了更好地描述本专利技术，下面通过具体的实施例予以进一步的说明，下述实施例 中的方法，如无特别说明，均为常规方法。实施例1 BcAlsl基因的相关性分析 灰霉病菌BcAlsl基因的开放阅读框由1918个核苷酸组成，包含2个外显子，编码区 cDNA全长为1851个核苷酸，编码的蛋白质产物由616个氨基酸组成。取BcAlsl蛋白质序列进 行比对分析(http://blast .ncbi .nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现A1 si广泛存在于动物、植 物、真菌和细菌等细胞生物中。结构域分析发现，BcAlsl蛋白质包含一个保守的氨基酮戊酸 合成酶结构域(见图1)。 实施例2 BcAlsl基因的敲除 1)敲除载体的构建 采用引物A1 s 1-UP-F (5 ' -GAATTCATGGTGCTCGTATCGTTTGA-3 '）与A1 s 1-UP-R (5 ' -GGTACCGCGGGATGATGGATTATTATGT-3 '），以灰霉病菌菌株B05.10的基因组DNA为模板扩增 BcAls 1 基因上游603bp片段，采用A1 s 1-DN-F(5 ' -GGATCCTCCTCGGACCCAATACCA当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种来自灰霉病菌(Botrytis cinerea)的控制致病性基因BcAls1，其特征在于其DNA序列如SEQ ID No:1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：秦庆明，曹胜男，李桂华，李乐涛，张明哲，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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