本发明专利技术提供了一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法，以魔芋飞粉为原料，通过耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共发酵制备魔芋多肽；采用硫酸铵分级沉淀法提取魔芋多肽中可溶性糖肽；然后将透析除盐后的粗糖肽依次通过DEAE-纤维素柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化；最后采用亲和层析的方法得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。本发明专利技术填补了以魔芋飞粉为原料结合发酵法、硫酸铵分级沉淀和色谱技术制备魔芋甘露聚糖肽的技术空白，同时也为魔芋飞粉的开发利用，生产高附加值产品开辟了一条新的道路，在食品、医药等领域具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物发酵和药用肽领域，涉及一种糖肽的制备方法，具体涉及。
技术介绍
甘露聚糖肽曾用名为多抗甲素，是我国首创的一种生物免疫增强剂。它是由不同链长的甘露聚糖肽分子组合在一起形成的混合物，不存在小分子糖类和游离氨基酸，其主要结构为多肽链与甘露聚糖连接。现代药理及临床研究表明:甘露聚糖肽具有明显的生物活性，它可以调节机体免疫紊乱，显著增强自身免疫力。现较多用于治疗免疫功能低下或免疫障碍性疾病，如反复感冒、反复呼吸道感染、白细胞减少和肿瘤的辅助治疗以减轻放、化疗的不良反应等，并取得了较好的疗效，临床应用越来越广泛。魔芋飞粉是在魔芋精粉加工过程中，飘落在周围的质量轻、颗粒小的细粉。魔芋飞粉中含有丰富的营养成分，蛋白质含量23.8%，水溶性糖分(甘露糖和葡萄糖)8.95%，是含高蛋白、低甘露聚糖的良好资源，但由于魔芋飞粉存在特殊的蛋腥味和臭味，目前主要用作动物饲料，利用率低。目前，国内制备甘露聚糖肽主要从菌株培养液中提取，来源较单一。例如，专利申请号为03117579.1、名称为甘露聚糖肽及其制备工艺及用途的中国专利，是从α-溶血链球菌的发酵产物中分离提取精制而成甘露聚糖肽。专利申请号为200710093102.2、名称为高纯度甘露聚糖肽的制备方法的中国专利、以及专利申请号为200710093103.7、名称为甘露聚糖肽的制备方法的中国专利，均以α-溶血链球菌H1S-33号为菌株，进行液体发酵制备甘露聚糖肽。目前并未见到有以魔芋飞粉为原料制备甘露聚糖肽的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，该方法以魔芋飞粉为原料，通过发酵得到甘露聚糖肽，该方法既能拓宽甘露聚糖肽的来源，又为魔芋飞粉的开发利用提供了一条新途径。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案为:—种魔芋甘露聚糖肽的制备方法，包括以下步骤:I)发酵:向每10mL培养基中加入魔芋飞粉I?4g，采用耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共生发酵，发酵完成后，发酵液经离心后去除菌体，取上清液，向其中加入I?5倍于上清液体积的纯化水，然后用三氯乙酸调节pH值至3.8?4.2，静置后去除沉淀，去除沉淀后得到的上清液即为魔芋糖肽液；2)硫酸铵分级沉淀:向魔芋糖肽液中加入硫酸铵晶体，使硫酸铵的饱和度达到20?80%，然后静置、离心，离心得到的沉淀用pH = 7?9的Tris-Hcl缓冲液溶解，再经透析后得到可溶性糖肽；3)用DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-1OO凝胶柱层析依次对可溶性糖肽进行分离纯化，得到魔芋甘露聚糖肽粗品； 4)将魔芋甘露聚糖肽粗品进行ConA-Sepharose4B亲和柱层析，即得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。所述步骤I)中的发酵工艺为:培养基的pH值为7.0?11.0，耐热解蛋白芽孢杆菌与短小芽孢杆菌的菌种比例为1: (I?3)，使用的菌液浓度为5X 17?5X 19个/mL，接种量为4?12 % (接种量为单位体积的培养基中接入的菌液的体积分数)，发酵温度为25?38°C，发酵时间为24?48h。所述步骤I)中的培养基是向每10mL蒸馈水中加入蛋白胨lg、牛肉膏1.5g、NaN〇30.08?0.39g、K2HP04 0.04?0.25g、KCl 0.01 ?0.12g、MgS04.7H20 0.01 ?0.12g和FeSO40.001?0.0lg后得到的。所述步骤I)中的发酵液在4°C下以8000?12000r/min的转速离心10?30min后去除囷体。所述步骤2)中的静置是在-4°C下静置10?20min，离心是在4°C及8000?12000r/min的转速下离心10?30min。所述步骤3)中的DEAE-52纤维素柱层析条件为:层析柱规格为(I?20)cmX(20?80)cm，上样量为I?500mL，依次用蒸馏水、0.05?0.15mo 1/L的NaHCO3溶液梯度洗脱，洗脱流速为0.5?80mL/min，每管收集2?4min，检测波长为280nm和490nm，合并同时具有糖、肽吸收峰的组分，浓缩、透析后备用。所述步骤3)中的SephadexG-1OO凝胶柱层析条件为:层析柱规格为(I?20) cm X(50?120)cm，上样量为3?350mL，洗脱剂为蒸馏水，洗脱流速为0.5?180mL/min，每管收集3?6min，检测波长为280nm和490nm，合并同时具有糖、肽吸收峰的组分，再经浓缩、透析、乙醇沉淀干燥后得到魔芋甘露聚糖肽粗品。 所述步骤4)中的ConA_Sepharose4B亲和柱层析条件为:层析柱规格为(I?20) cmX (20?40)cm，上样量为2?180mL，用0.2?0.5mol/L的α-甲基-D-甘露糖苷溶液竞争洗脱，洗脱流速为0.5?80mL/min，收集液经透析、浓缩、乙醇沉淀干燥后得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。制得的魔芋甘露聚糖肽中所含的甘露糖和葡萄糖的质量比为1.7:(I?4)。相对于现有技术，本专利技术的有益效果为:本专利技术提供的魔芋甘露聚糖肽的制备方法，在培养基中加入魔芋飞粉，通过耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共生发酵得到魔芋糖肽液;然后采用硫酸铵分级沉淀提取魔芋糖肽液中的可溶性糖肽；再将可溶性糖肽依次通过DEAE-52纤维素柱层析和SephadexG-1OO凝胶柱层析进行分离纯化;最后采用ConA-Sepharose4B亲和柱层析得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。本专利技术以魔芋飞粉为原料，结合发酵法、硫酸铵分级沉淀和色谱层析分离技术制备出魔芋甘露聚糖肽，发掘了魔芋飞粉的利用价值，拓宽了甘露聚糖肽的制备方法。运用本专利技术的方法，可以得到魔芋甘露聚糖肽，证实了魔芋飞粉是甘露聚糖肽的一种理想来源，填补了以魔芋飞粉为原料制备魔芋甘露聚糖肽的技术空白，既能拓宽甘露聚糖肽的来源，同时也为魔芋飞粉的开发利用、生产高附加值产品开辟了一条新的道路，在食品、医药等领域具有重要意义。进一步的，对本专利技术制得的魔芋甘露聚糖肽的单糖成分进行了分析检测，发现制得的魔芋甘露聚糖肽中所含的单糖主要是甘露糖和葡萄糖，且甘露糖和葡萄糖质量比为1.7:(I?4)，可为魔芋甘露聚糖肽进一步在食品、医药等领域中的应用提供参考。【附图说明】图1为甘露聚糖肽标准品的氨基酸图谱；图2为本专利技术制得的魔芋甘露聚糖肽的氨基酸图谱；图3为甘露糖、葡萄糖混合标准品的高效液相色谱图；图4为本专利技术制得的魔芋甘露聚糖肽的单糖水解物的高效液相色谱图。【具体实施方式】下面结合实施例来详细说明本专利技术的技术方案。应理解，以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术步骤或条件所做的修改或替代，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术提供了，以魔芋飞粉为原料，通过耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共发酵制备魔芋多肽;采用硫酸铵分级沉淀法提取魔芋多肽中可溶性糖肽;然后将透析除盐后的粗糖肽依次通过DEAE-纤维素柱层析和凝胶柱层析进行分离纯化;最后采用亲和层析的方法得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。本专利技术填补了以魔芋飞粉为原料结合发酵法、硫酸铵分级沉淀和色谱技术制备魔芋甘露聚糖肽的技术空白，同时也为魔芋飞粉的开发利用，生产高附加值产品开辟了一条新的道路，在食品、医药等领域具有重要意义。下面结合具体的实施例对本专利技术进行进一步详细说明。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种魔芋甘露聚糖肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)发酵：向每100mL培养基中加入魔芋飞粉1～4g，采用耐热解蛋白芽孢杆菌和短小芽孢杆菌共生发酵，发酵完成后，发酵液经离心后去除菌体，取上清液，向其中加入1～5倍于上清液体积的纯化水，然后用三氯乙酸调节pH值至3.8～4.2，静置后去除沉淀，去除沉淀后得到的上清液即为魔芋糖肽液；2)硫酸铵分级沉淀：向魔芋糖肽液中加入硫酸铵晶体，使硫酸铵的饱和度达到20～80％，然后静置、离心，离心得到的沉淀用pH＝7～9的Tris‑Hcl缓冲液溶解，再经透析后得到可溶性糖肽；3)用DEAE‑52纤维素柱层析和SephadexG‑100凝胶柱层析依次对可溶性糖肽进行分离纯化，得到魔芋甘露聚糖肽粗品；4)将魔芋甘露聚糖肽粗品进行ConA‑Sepharose4B亲和柱层析，即得到纯化的魔芋甘露聚糖肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：毛跟年，贾莹，张诗韵，许牡丹，
申请(专利权)人：陕西科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。