本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体提供了硬蜱科蜱虫COIII基因全长序列的扩增引物及其应用。本发明专利技术提供的硬蜱科蜱虫COIII基因的全长序列扩增引物如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其可有效扩增硬蜱科线粒体COⅢ基因序列全长(778bp)，扩增效率达到98.5％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物学领域，具体地说，涉及硬蜱科蜱虫C0III基因全长序列的 扩增引物及其应用。
技术介绍
硬蜱科（Ixodidae)隶属于节肢动物门（Arthropoda)，蛛形纲（Arachnida)，蜱 目（Ixodida)。目前，全世界已知硬蜱种类超过700种，我国硬蜱记录有效种分属于硬蜱属 (Ixodes)、花蜱属（Amblyomma)、血蜱属（Haemaphysalis)、革蜱属（Dermacentor)、璃眼蜱 属（Hyalomma)、扇头蛛属（Rhipicephalus)以及异扇蛛属（Anomalohimalaya)7 个属共 106 种。蜱类在宿主体上吸食血液，对人和家畜危害很大。蜱虫的叮咬，不仅造成宿主血液损失， 还可引起宿主皮肤出现炎症、溃疡等症状。更重要的是，硬蜱作为媒介可传播人、畜疫病，包 括病毒病（森林脑炎、出血热）、立克次体病（Q热）、细菌病（布氏杆菌）、螺旋体病（莱姆 病）以及原虫病（巴贝斯虫、泰勒虫）等。蜱虫的物种鉴定及蜱媒分布调查是蜱媒及蜱传疫 病防控的重要基础。传统蜱虫物种的分类鉴定主要依据形态学，然而形态学的鉴定需要经 验丰富的专家，而且形态学对蜱虫未成熟个体（卵、幼虫）及虫体不完整的标本难以鉴定。 分子生物学技术可解决上述难题。 利用分子技术对物种进行分类和系统发育分析已成为一种有效的方法。线粒体 C0III基因具有较高的进化速率和种内保守性，是鉴定物种和研究物种间进化关系较为理想 的靶标基因。然而，Genbank数据库中硬蜱COIII序列较少，且缺少扩增硬蜱科COIII基因的 通用引物，严重制约了C0III序列在蜱虫系统发生及蜱媒流行病学调查研究中的应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种硬蜱科蜱虫C0III基 因全长序列的扩增引物。 为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供一种硬蜱科蜱虫C0III基因全长序列的扩 增引物，其包括： C0III-TF:5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3' ； C0III-TR:5'-AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。 本专利技术还提供一种含有所述引物的用于检测硬蜱科蜱虫的试剂盒。 进一步地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg'PCR反应缓冲液中的至 少一种。 进一步地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。 本专利技术还提供了所述引物或所述试剂盒在检测硬蜱科蜱虫中的应用。 本专利技术还提供了硬蜱科蜱虫的特异性PCR检测方法，包括以下步骤： 1)提取样品DNA; 2)以步骤1)提取的DNA为模板，利用所述的引物C0III-TF和C0III-TR进行PCR 扩增反应； 3)分析PCR产物。 进一步地，PCR反应体系以50μ1计为：5yL10XPCRbuffer，2yL引物 〇)111-丁？，2以1^引物〇)111-丁1?，2 4 1^(1^138(101111)，4 4 1 2. 5mMMgCl2,1μLTaq酶，蜱虫 DNA模板基因组2μL(10~20ng)，加灭菌双蒸水至50μ1。 进一步地，PCR反应条件为：PCR扩增程序：94°C预变性5min;94°C变性30S，45°C 退火30S，72°C延伸lmin，共36个循环；72°C延伸7min，4°C保存。 本专利技术的有益效果在于： 本专利技术提供的硬蜱科蜱虫coin基因的扩增引物，可有效扩增硬蜱科线粒体com 基因全长序列，扩增效率达到98. 5%。【附图说明】 图1为用本专利技术所述引物对11种蜱虫DNA样本进行PCR检测的1%琼脂糖凝胶电 泳图； 其中：1 :全沟硬蜱Ixodespersuleatus;2 :边缘革蜱Dermacentormarginatus; 3 :嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna;4 :长角血蜱Haemaphysalislongicornis;5 :亚 洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum;M:DL2000Marker;6 :日本血蜱Haemaphysalisjaponica; 7:微小扇头蜱Rhipicephalusmicroplus;8:小亚璃眼蜱Hyalommaanatolicum;9:草原 革蜱Dermacentornuttalli;10 :草原血蜱Haemaphysalisverticalis;11 :残缘璃眼蜱 Hyalommadetritum。【具体实施方式】 以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。 实施例1 1、数据收集：从Genbank中下载硬蜱科不同蜱虫物种线粒体COIII基因序列 (NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 2、序列比对：利用MEGA软件中的ClustalW程序将收集到的硬蜱科蜱虫COIII序列 进行序列比对，找出较保守、碱基变异度最小的序列片段。 3、引物合成：根据上述的比对结果，利用引物设计软件Primerf在碱基变异度最 小的序列片段设计出1对兼并扩增引物。 引物序列为： C0III-TF:5'-ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT-3' ； C0III-TR:5' -AATAAATTCATCAATATATAAATGTA-3'。 4、引物扩增：将上述引物分别应用于PCR扩增所采集的表1所示的硬蜱科5个属 11个种265个个体的COIII序列的PCR扩增。 表1硬蜱科5个属11个种 5、扩增结果检测：扩增产物用1. 5倍的琼脂糖凝胶电泳进行检测（见图1)。结果 显示，该引物可有效扩增硬蜱科线粒体COIII基因序列，共获得265个硬蜱样本中的261个 个体的C0III全长序列，扩增效率达到98. 5%。利用此对引物扩增出的DNA片段长度约为 780bp〇 针对扩增产物进行测序，获取了全沟硬蜱Ixodespersuleatus、边缘革蜱 Dermacentormarginatus、嗜群血蜱Haemaphysalisconcinna、长角血蜱Haemaphysalis longicornis、亚洲璃眼蜱Hyalommaasiaticum、曰本血蜱Haemaphysalisjaponica、 微小扇头蜱Rhipicephalusmicroplus、小亚璃眼蜱Hyalommaanatolicum、草原革蜱 Dermacentornuttall、草原血蜱Haemaphysalisverticalis和残缘璃眼蜱Hyalomma detritum共11个种的线粒体COIII基因序列，其具体的核苷酸序列见SEQIDNo. 3-13。 特异性扩增引物条件： 上述C0III-TF与C0III-TR扩增引物的50yL PCR反应体系为：5yL10XPCR buffer，2 μL引物CO III -TF，2 μL引物CO III -TR，2 μL dNTPs (10mM)，4 μ1 2. 5mM MgCl2， 1 μL Taq酶，蜱虫DNA模板基因组2 μL (10~20ng)，加灭菌双蒸水至50 μ1。PCR反应条件：预热 94°C，5min;94°C30s，45°C30s，72°Clmin，共 36 个循环；末次 延伸 72°(：，711^11，4本文档来自技高网...
【技术保护点】
硬蜱科蜱虫COIII基因全长序列的扩增引物，其特征在于，其包括：COIII‑TF：5'‑ATGATATTTCATCCTTTTCACTTAGT‑3'；COIII‑TR：5'‑AATAAATTCATCAATATATAAATGTA‑3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吕继洲，韩雪清，王慧煜，袁向芬，贾广乐，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11
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