包括基于金黄色葡萄球菌A蛋白的新配体的层析基质制造技术

本发明专利技术涉及层析基质，其包括基于免疫球蛋白结合蛋白如金黄色葡萄球菌A蛋白(SpA)的一个或多个结构域的配体，也涉及它们的使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】包括基于金黄色葡萄球菌A蛋白的新配体的层析基质[00011 本申请为申请日为2012年6月8日、申请号为201210273398.7、专利技术名称为"包括基 于金黄色葡萄球菌A蛋白的新配体的层析基质"的专利技术专利申请的分案申请。 相关申请 本申请要求2011年6月8日提交的美国临时专利申请61/494701的优先权，在此通 过援引的方式将其全部内容并入本申请。 专利
本专利技术涉及层析基质，其包括基于免疫球蛋白结合蛋白（如金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)A蛋白（SpA))的一个或多个结构域的配体，也涉及它们的使用方 法。
技术介绍
用于亲和层析的配体通常对于靶分子具有高选择性，从而能够以高产率、高纯度、 快速且经济的方式纯化靶分子。基于金黄色葡萄球菌A蛋白的试剂和层析介质已经在亲和 层析领域得到广泛应用，用于捕获和纯化抗体和含有Fc的蛋白；由于其能够结合IgG，且不 会显著影响免疫球蛋白与抗原的亲和力，因此在规模化分析抗体检测方法中也得到广泛应 用。 因此，包含A蛋白配体的各种试剂和介质已经建立起来并通过商业途径可以获得， 例如 /ProSepdvAHigh Capacity、Pr〇Sep?-vA.Ultra和ProSep? UltraPlus (MILLIPORE)和Protein A Sepharose?、MabSelect?、MabSelect Xtra?、MabSelect SuRe? (GE HEALTHCARE)、MabSelect SuRe? LX和Poros MasCapture A ?(LIFE TECHNOLOGIES)。 为了保持层析配体(包括配体结合型固相支持物如结合SpA的层析基质）的选择 性，基质需要进行清洗，而且通常在酸性或碱性条件下清洗，如用氢氧化钠(NaOH)。例如，用 于基质清洗和再生的标准过程是碱性原位清洗(CIP)方法，其通常包括用浓度为0.05M-1M 的NaOH处理结合配体的基质，使pH范围位于12.7-14.0。一般来讲，将亲和层析基质进行重 复原位清洗循环会导致基质对靶分子的结合能力随清洗时间的延长而显著丧失，从而整个 过程需要更多量的通常很昂贵的与基质结合的配体。由于这样会导致纯化过程更加昂贵并 且时间延长，因此既不够经济也不是所期望的。
技术实现思路
基于A蛋白的层析基质之前在现有技术中已有描述，其表现出在碱性条件下处理 后对于靶分子的结合能力下降。参见，如公开号为20100221844的美国专利出版物描述的亲 和层析基质以多点连接的方式将野生型(wt)SpA的B或Z结构域结合到基质上，即使用0.5M NaOH处理5小时或更长时间，其也能达到起始结合能力的95%。此外，公开号为20100048876 的美国专利出版物描述了一种结合了野生型SpA的C结构域和含有3-6个氨基酸缺失的C结 构域的亲和层析基质，用〇. 5M NaOH处理约5小时，其达到起始结合能力的95%。这些配体通 过半胱氨酸引导的单点连接方式固定到基质上。进一步地，已经有文献描述了结合在一个 或多个天冬氨酸位点含有突变的A蛋白的层析基质，在碱性条件下处理后，其基质显示出结 合能力相对于野生型SpA有所下降，其通过单点连接方式固定到基质上。参见如US专利 6831161。 尽管前述提到的亲和层析基质在苛性条件(caustic conditions)下处理后，似乎 显示出对于靶分子的结合能力有所下降，但在苛性条件下处理后，其中许多基质显示出很 大程度的配体片段化，如使用SDS-PAGE和/或尺寸排阻层析（SEC)可以观察到。由于很大程 度的配体片段化产生的配体小片段难以从靶分子中去除和分离，从而增加潜在的免疫原性 片段与治疗性靶分子共纯化的可能，因此这种片段化是不利的。此外，很大程度的片段化导 致加剧基质与祀分子结合能力的下降。 本专利技术提供了亲和层析配体和结合该配体的基质，其中所述配体基于一个或多个 金黄色葡萄球菌A蛋白（SpA)的结构域，该结构域具有从N末端第1位或第2位起始的缺失突 变。这些配体和基质在纯化使用时的片段化问题相对于之前描述的配体有所下降，这一点 通过SDS-PAGE和/或SEC技术可以证实，从而使得它们成为用于亲和层析的更有吸引力和更 加经济的选择。 本专利技术的一个方面提供了亲和层析基质，其包括具有缺失突变的一个或多个SpA 蛋白B结构域，具有缺失突变的一个或多个SpA蛋白C结构域或具有缺失突变的一个或多个 SpA蛋白Z结构域，其中一个或多个结构域结合到固相支持物上。 在一个实施方式中，本专利技术的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其 中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白（SpA)B结构域，其中至少一个B结构域包 含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。在另一实施方式中，本专利技术的亲和层析基质包 括结合到固相支持物上的配体，其中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白（SpA) 的C结构域，其中至少一个C结构域包含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。 在另一实施方式中，本专利技术的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其 中所述配体包含一个或多个金黄色葡萄球菌A蛋白（SpA)的Z结构域，其中至少一个Z结构域 包含位于N末端的至少3个连续氨基酸的缺失。 在又一实施方式中，本专利技术的亲和层析基质包括结合到固相支持物上的配体，其 中所述配体包含两个或更多个B结构域，两个或更多个C结构域或两个或更多个Z结构域，或 B、C和Z结构域的任意组合，其中至少一个B、C或Z结构域包含位于N末端的至少3个连续氨基 酸的缺失。 在本专利技术的各种实施方式中，每个配体上多于一个位点连接到固相支持物（即多 点连接）。 在本专利技术的各种实施方式中，所述配体或含有配体的基质经0.5M NaOH处理至少5 小时后，配体相对于其野生型对应物显示出降低的片段化，这通过SDS-PAGE或尺寸排阻层 析(SEC)可以确定。 在本专利技术的一些实施方式中，所述配体包含N末端3个氨基酸缺失，N末端4个氨基 酸缺失，或N末端5个氨基酸缺失，其中配体上多于一个位点连接到固相支持物，从而形成亲 和层析基质。 在一特定的实施方式中，配体具有SEQ ID N0:13-42、SEQ ID N0:55-84和SEQ ID NO: 93-94中任一所示的氨基酸序列。在另一实施方式中，本专利技术的配体具有下列结构： n+m，其中X代表SpA蛋 白的B结构域、Z结构域或C结构域，η代表从零至(m-1)范围的结构域数目，Y代表N末端缺失 至少3个连续氨基酸的SpA蛋白B结构域、Z结构域或C结构域，m代表范围是1-8的Y结构域的 数目，其中所述配体多于一个位点连接到固相支持物(如层析基质）。 在本专利技术的一些实施方式中，所述配体包含SpA蛋白的两个B结构域或两个Z结构 域或两个C结构域，或一个B和一个C结构域，或一个B和一个Z结构域，或一个C和一个Z结构 域，其中至少一个B结构域或至少一个Z结构域或至少一个C结构域包括N末端3个连续氨基 酸缺失或N末端4个连续氨基酸缺失或N末端5个连续氨基酸缺失。应该理解，各种结构域可 以任意顺序分布。 在另一实施方式中，本专利技术的配体包含三个B结构域或三个Z本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含一个或多个葡萄球菌A蛋白(SpA)C结构域的亲和层析配体，其中至少一个C结构域包含从N末端第1位或第2位起始的至少3个连续氨基酸的缺失。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：S·斯佩克特，R·史密斯，J·奥兰多，N·比安，
申请(专利权)人：EMD密理博公司，
类型：发明
国别省市：美国;US