突变检测分析制造技术

本发明专利技术提供一种样品分析方法。在某些实施方案中，所述方法包括：a)扩增来自包括基因组座位的野生型拷贝和与基因组座位的所述野生型相关的一个点突变的基因组座位突变体拷贝的样品的产物，以生成扩增的样品，其中：i.扩增使用第一引物和第二引物完成；并且ii.第一引物包括与点突变碱基配对的3’末端核苷酸和还包括与基因组座位除了在3’末端核苷酸6个碱基内有一个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；和b)使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本发明专利技术还提供进行所述方法的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
本申请是2011年11月2日提交的同名专利技术专利申请201180053023.3的分案申请。【相关申请的交叉引用】本申请要求2010年11月15日递交的美国专利申请系列号12/946,752的申请日的优先权，该申请公开的内容通过引用的方式并入本文。【背景】人类基因组中的一些点突变与疾病有直接关联。例如，发现一些生殖系KRAS突变与努南综合征(Schubbert等人Nat.Genet.200638:331–6)和心-面-皮肤综合征(Niihori等人.Nat.Genet.200638:294–6)相关联。同样，发现体细胞的KRAS突变在白血病、结直肠癌(Burmer等人.Proc.Natl.Acad.Sci.198986:2403–7)、胰腺癌(Almoguera等人.Cell198853:549–54)和肺癌(Tam等人.Clin.CancerRes.200612:1647–53)中高频出现。人类基因组中有许多点突变与疾病没有明显的致病关联。点突变的检测方法可用于，例如，提供与点突变相关联的疾病的诊断。【概述】本专利技术提供样品分析的方法。在某些实施方案中，所述方法包括：a)从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含基因组座位的野生型拷贝和所述基因组座位的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于所述基因组座位的所述野生型拷贝具有点突变，其中：i.扩增使用第一引物和第二引物完成；以及ii.第一引物包含与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还包含与所述基因组座位中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；和b)使用活瓣分析(flapassay)检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用侵入寡核苷酸。本专利技术还提供进行所述方法的试剂盒。【附图说明】图1示例性说明了活瓣分析的一些一般原则。图2示例性说明了所述方法的一个实施方案。图3-7各提供更详细描述于本申请实施例部分的数据。【定义】本文使用的术语“样品”涉及材料或材料的混合物，通常情况下，尽管这不是必须的，以液体形式，含有一种或多种感兴趣的分析物。术语“核苷酸”旨在包括那些不仅包含已知嘌呤和嘧啶碱基而且包含已被修饰的其他杂环碱基的基团(moieties)。这些修饰包括甲基化的嘌呤或嘧啶，酰基化的嘌呤或嘧啶，烷基化的核糖或其他杂环。此外，术语“核苷酸”包括那些包含半抗原或荧光标记并可以不仅包含常规核糖和脱氧核糖的糖，而且也可以包含其他糖的基团。修饰的核苷或核苷酸也包括对所述糖基团的修饰，例如，一个或多个羟基被卤素原子或脂肪族基团取代，官能化为醚、胺等。术语“核酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用，用于描述任意长度的聚合物，例如，长于大约2个碱基，长于大约10个碱基，长于大约100个碱基，长于大约500个碱基，长于大约1000个碱基，长达大约10,000个或更多碱基组成的核苷酸，例如，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，并可通过酶法或合成法制备(例如，PNA记载于美国专利号5,948,902和其中所引用的参考文献)其可以与天然存在的核酸以序列特异性的方式进行杂交，该方式与两种天然存在的核酸杂交类似，例如，能够参与沃森-克里克碱基配对相互作用。天然存在的核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶(分别为G、C、A和T)。本文使用的术语“核酸样品”指含有核酸的样品。本文使用的术语“靶多核苷酸”指研究中的目的多核苷酸。在某些实施方案中，靶多核苷酸含有研究中的一个或多个目的靶位点。本文使用的术语“寡核苷酸”指大约2至200个核苷酸的核苷酸单链多聚体。寡核苷酸可以通过合成或可以通过酶法制备，并且，在一些实施方案中，长度为10至50个核苷酸。寡核苷酸可以含有核糖核苷酸单体(即，可以为寡核糖核苷酸)或脱氧核糖核苷酸单体。例如，寡核苷酸的长度可以为10至20、11至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至200个核苷酸。本文使用的术语“双链体”或“双链的”描述两个互补的碱基配对的多核苷酸，即，杂交在一起。本文使用的术语“引物”指这样的寡核苷酸，其具有与靶多核苷酸的一个区域互补的核苷酸序列。在引物延伸条件下，使用靶核酸作为模板，引物结合至所述互补区域并延伸。引物可为大约15至大约50个核苷酸范围内，但也可使用在上述长度范围之外的引物。引物可通过聚合酶的作用从引物的3’末端开始延伸。不能通过聚合酶的作用从其3’末端开始延伸的寡核苷酸不是引物。本文使用的术语“延伸”指向核酸末端添加一个或更多的核苷酸，例如通过寡核苷酸的连接或通过使用聚合酶。本文使用的术语“扩增”指使用靶核酸作为模板产生一个或更多拷贝的靶核酸。本文使用的术语“变性”指核酸双链体分开为两条单链。本文的术语“测定(determining)”、“测量(measuring)”、“评估(evaluating)”、“评估(assessing)”、“分析(assaying)”、“检测(detecting)”、“分析(analyzing)”可以互换使用，指任何形式的测量，并包括测定一种成分(element)存在与否。这些属于包括定性和/或定量测定。评估可为相对或绝对。“评估其存在”包括测定存在的某种物质的量，以及测定其存在或不存在。术语“使用”有其常规含义，因此，是指采用，例如，将方法或组合物付诸运行至结束。本文使用的术语“Tm”指寡核苷酸双链体的解链温度，在该温度，一半的双链体保持杂交而一半的双链体解离成单链。寡核苷酸双链体的Tm可以通过实验测定或使用下述公式预测：Tm＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(部分G+C)–(60/N)，其中N是链长且[Na+]小于1M。参见Sambrook和Russell(2001；MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarborN.Y.,ch.10)。还有其他预测寡核苷酸双链体的Tm的公式并且一个公式可以或多或少地适用于给定的条件或一组条件。本文使用的术语“Tm-匹配的”指多个核酸双链体有在定义范围内的Tm，例如，在互相的5℃或10℃范围内。本文使用的术语“反应混合物”指试剂的混合物，所述试剂能够在能够在适当的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于非诊断目的的样品分析方法，其包括：(a)从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含KRAS的野生型拷贝和KRAS的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于KRAS的所述野生型拷贝具有点突变；其中：(i)所述扩增使用第一引物和第二引物完成；以及(ii)所述第一引物包含与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还包含与KRAS中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；(b)使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所述活瓣分析采用：(i)所述第一引物，和(ii)活瓣寡核苷酸，其包含与所述点突变碱基配对的核苷酸。

【技术特征摘要】
2010.11.15 US 12/946,7521.一种用于非诊断目的的样品分析方法，其包括：
(a)从样品扩增产物以产生扩增的样品，所述样品包含KRAS
的野生型拷贝和KRAS的突变体拷贝，所述突变体拷贝相对于KRAS
的所述野生型拷贝具有点突变；其中：
(i)所述扩增使用第一引物和第二引物完成；以及
(ii)所述第一引物
包含与所述点突变碱基配对的3’末端核苷酸，还
包含与KRAS中除了在所述3’末端核苷酸6个碱基内具有单
个碱基错配之外的序列完全互补的核苷酸序列；
(b)使用活瓣分析检测所述扩增的样品中所述产物的存在，所
述活瓣分析采用：
(i)所述第一引物，和
(ii)活瓣寡核苷酸，其包含与所述点突变碱基配对的核苷酸。
2.权利要求1的方法，其中所述样品含有的KRAS的野生型拷
贝为KRAS的突变体拷贝的至少100倍。
3.权利要求1的方法，进一步包括
将所述扩增的样品中所述产物的量相对于所述样品中存在的对照
核酸的量进行标准化，
从而确定所述样品中所述突变拷贝的量。
4.权利要求3的方法，其中所述对照核酸是不同于KRAS的座
位。
5.权利要求1的方法，
其中所述活瓣分析采用第一活瓣分析试剂，所述第一活瓣分析试

\t剂包括所述具有第一活瓣和第一FRET盒的第一活瓣探针，并且
其中所述对照核酸使用第二活瓣分析试剂来检测，所述第二活瓣
分析试剂包括具有第二活瓣和产生可区分于所述第一FRET盒的信号
的第二FRET盒的第二活瓣探针，
其中所述第一和第二活瓣试剂处于相同的反应混合物中。
6.权利要求1的方法，其中所述样品获取自人。
7.权利要求6的方法，其中所述样品是自粪便提取的DNA。
8.权利要求1的方法，其中所述第一引物中所述错配是相对于所
述末端核苷酸位于位置-1、位置-2、位置-3、位置-4或位置-5。
9.权利要求1的方法，其中
所述扩增和检测步骤使用含有PCR试剂和活瓣试剂的反应混合
物完成，并且
在所述扩增和检测步骤之间没有向所述反应混合物中加入额外的
试剂。
10.权利要求1的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩
增和检测第二基因组座位的PCR试剂和活瓣试剂。
11.权利要求10的方法，其中所述反应混合物进一步包含用于扩
增和检测第二基因组座位中点突变的PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹鸿志，G·P·李德加德，M·J·多马尼科，H·阿拉维，
申请(专利权)人：精密科学公司，
类型：发明
国别省市：美国;US