一种用于鱼类线粒体全基因组扩增的引物、试剂盒及扩增方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鱼类线粒体全基因组扩增的引物、试剂盒，还公开了鱼类线粒体全基因组DNA的扩增方法、测序方法。本发明专利技术利用给定的引物直接扩增结合直接测序的方法，能够得到鱼类线粒体全基因组序列,可以一次性检测鱼类不同物种、同一个物种不同个体线粒体基因的全部碱基突变,能够应用于全部鱼类线粒体基因组研究。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一组可用于鱼类线粒体全基因组序列研究的引物，用于序列扩增试剂盒、测序、检测DNA单个碱基突变的方法。
技术介绍
线粒体是细胞内的能量转换器，拥有独立于核基因组序列的线粒体基因组。不同于核基因组，线粒体基因组具有多个特征：(1)分子较小，且存在长度多态性，不同于基因组序列，线粒体基因组的序列由于串联重复序列的存在而大小不。(2)编码效率高，由于没内含子的存在，线粒体基因组序列短，但包含大量基因。(3)拷贝数多，每个细胞中含有不少于1000个线粒体基因组。(4)遗传和复制相对独立性，几乎不受细胞核的控制。(5)高突变率，由于线粒体数量的大量变化，线粒体DNA几乎在整个细胞的生存过程中都在复制，这导致了线粒体DNA上出现了大量的变异碱基，且这些突变不会危及到细胞的生存，突变碱基会保留下来。(6)同质性与异质性，每个个体细胞中的线粒体基因组DNA序列存在原始序列和突变序列，并且存在一定分配比例。(7)母系遗传，有性繁殖的个体中仅卵细胞存在大量线粒体，精子几乎不含有线粒体，因此一个个体的线粒体基因全部来自母本。这些特征为科技工作者研究生物的生存、进化、物种迁徙等提供了有利条件。鱼类线粒体基因组为环状双链DNA，在细胞中存在成千上万的拷贝，尤其在生长状态较好的细胞中大量存在，线粒体DNA的数量在一定程度上反映了细胞的生活状态。研究表明鱼类线粒体的DNA非常保守，物种间的差异较小。鱼类线粒体基因组非常小，约为15-20Kb之间，仅占整个个体全部基因信息(核基因组和线粒体基因组)的1％。鱼类线粒体基因组主要包括37个编码基因(13个蛋白基因，2个核糖体RNA(rRNA)基因,22个转运RNA(tRNA)编码基因，2个转录和复制起始区域。基因编码的蛋白包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的亚单位:细胞色素、ATP合成酶的亚基、细胞色素氧化酶的亚基以及氢化辅酶I脱氢酶的亚基。由于线粒体DNA缺少蛋白保护，加上高复制效率，缺乏校对机制等，导致线粒体DNA的序列变异效率高，而个体的异质性(突变DNA和原始DNA的比例)和线粒体序列的多态性(长度多态性，单个碱基位点多态性)可作为一个物种的分子标记，借此进行类群识别、物种起源进化、鱼种迁徙等研究。目前为止，进行线粒体基因组多态性研究的方法包括：(1)直接测序；(2)内切酶图谱；(3)扩增长度多态性；(4)探针杂交法等。随着测序技术的发展及测序费用的降低，直接测序方法已经越来越方便快捷，目前，鱼类线粒体基因组主要通过设计通用引物，进而获得鱼类线粒体DNA的全序列。因此引物设计的好坏直接决定了实验的成败，因此开发一个简便、通用的鱼类线粒体基因组测序的方法具有重要的实用价值。
技术实现思路
本专利技术提供一组通用的鱼类线粒体基因组扩增、测序的引物，同时提供进行鱼类线粒体DNA进行扩增的方法。本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：进行鱼类线粒体DNA序列比对时发现，部分序列存在极大的保守性，在几乎所有已知物种的线粒体DNA序列中，这些序列均存在，而鱼类的线粒体DNA是环状的，可以通过使用2-3对引物即可以完成线粒体序列的克隆，因此在进行了大量线粒体DNA序列分析后，根据最保守的12个区域设计了6对引物，这六对引物可以完成一个物种的全部线粒体序列的扩增和测序工作。具体如下：一种用于鱼类线粒体全基因组扩增的引物，所述引物为以下1～6对引物中的一对或多对：用于鱼类线粒体全基因组扩增的第1对正向引物为5’-TTANACATGCAAGTNTCCGC-3’，反向引物为5’-ACTGACCTGGATTNCTCCGG-3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第2对正向引物为5’-GACGAGAAGACCCTTTGGAG-3’，反向引物为5’-GAGGGTGCCAATGTCTTTATG-3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第3对正向引物为5’-AGGCCTCGATCCTACAAACTC-3’，反向引物为5’-ATGGGCTTGGGTCAACTATG-3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第4对正向引物为5’-GGAATACGAAATCAACCAACAA-3’，反向引物为5’-TTTGGGTCGGAGTGTATGTATC-3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第5对正向引物为5’-CTCTTGGTGCAANTCCAAG-3’，反向引物为5’-GCGGANCTTGCATGTNTAA-3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第6对正向引物为5’-GTGAACTATTACTGGCATCTGGT-3’，反向引物为5’-TTACGGCTAAGCATAGTGGG-3’。—种用于鱼类线粒体全基因组扩增的试剂盒，所述试剂盒含有上述的1对或多对引物。一种鱼类线粒体全基因组扩增方法，采用权利要求1所述的引物，以鱼类线粒体DNA为模板，进行PCR扩增。进一步，所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为52～56℃。本专利技术优势在于：可以进行任何鱼类物种的线粒体DNA的测序，而且对模板的要求不是特别严格，效率高、准确率高。本专利技术的目的是提高扩增准确性和效率，减少鱼类线粒体DNA序列测序时大量消耗的引物设计和优化时间，提高引物通用性，提高扩增产物的准确性，提供一种可用于全部鱼类线粒体全基因组序列扩增和测序的引物对。附图说明图1是采用本专利技术6对引物扩增日本繸鳚线粒体基因组得到的电泳图,1-6分别为1-6号引物扩增结果，M为DNA标准marker；图2是采用本专利技术6对引物扩增、测序拼接得到的日本繸鳚全线粒体基因组基因图谱。具体实施方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步详细的说明。鱼类线粒体DNA基因组的高复制率和高突变性，其可作为一个研究物种差异和资源分布和调查的分子标记。线粒体DNA全基因组的扩增很大程度上依赖引物设计的优良与否。本专利技术开发出一种用6对引物多重PCR扩增出鱼类线粒体DNA全基因组序列的测序系统，以解决上述问题。本专利技术合成了能够扩增出鱼类线粒体全基因组碱基的6对高特异性PCR引物。本专利技术涉及的这6对PCR引物，经实验证明，能够对鱼类线粒体全基因组进行特异性扩增，并通过直接测序的方法得到真实可靠的线粒体全基因组序列资料。选用上述线粒体全基因组测序用6对PCR引物，将上下游引物稀释成10umol/ml作为工作液。PCR反应体系：体系总体积为20u1，其中含DNA模板1ul(含50-100ng全基因组DNA)，目的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鱼类线粒体全基因组扩增的引物，其特征在于：所述引物为以下1～6对引物中的一对或多对：用于鱼类线粒体全基因组扩增的第1对正向引物为5’‑TTANACATGCAAGTNTCCGC‑3’，反向引物为5’‑ACTGACCTGGATTNCTCCGG‑3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第2对正向引物为5’‑GACGAGAAGACCCTTTGGAG‑3’，反向引物为5’‑GAGGGTGCCAATGTCTTTATG‑3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第3对正向引物为5’‑AGGCCTCGATCCTACAAACTC‑3’，反向引物为5’‑ATGGGCTTGGGTCAACTATG‑3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第4对正向引物为5’‑GGAATACGAAATCAACCAACAA‑3’，反向引物为5’‑TTTGGGTCGGAGTGTATGTATC‑3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第5对正向引物为5’‑CTCTTGGTGCAANTCCAAG‑3’，反向引物为5’‑GCGGANCTTGCATGTNTAA‑3’；用于鱼类线粒体全基因组扩增的第6对正向引物为5’‑GTGAACTATTACTGGCATCTGGT‑3’，反向引物为5’‑TTACGGCTAAGCATAGTGGG‑3’。...

【技术特征摘要】
1.一种用于鱼类线粒体全基因组扩增的引物，其特征在于：所述引物为以下1～6对引
物中的一对或多对：
用于鱼类线粒体全基因组扩增的第1对正向引物为5’-TTANACATGCAAGTNTCCGC-3’，反
向引物为5’-ACTGACCTGGATTNCTCCGG-3’；
用于鱼类线粒体全基因组扩增的第2对正向引物为5’-GACGAGAAGACCCTTTGGAG-3’，反
向引物为5’-GAGGGTGCCAATGTCTTTATG-3’；
用于鱼类线粒体全基因组扩增的第3对正向引物为5’-AGGCCTCGATCCTACAAACTC-3’，反
向引物为5’-ATGGGCTTGGGTCAACTATG-3’；
用于鱼类线粒体全基因组扩增的第4对正向引物为5’-GGAATACGAAATCAACCAACAA-3’，
反向引物为5’-TTTGGG...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙珍霞，陈亚东，陈学杰，于孟君，孙璐明，单秀娟，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37