本发明专利技术公开了一种黄瓜基因CsMADS09的表达载体及其在增加果荚数量中的应用，属于生物技术领域。该表达载体为含有双35S启动子和黄瓜CsMADS09基因植物表达载体。在拟南芥中过量表达CsMADS09，获得的CsMADS09转基因植株顶端果荚数明显增加。利用CsMADS09基因获得的果荚数增加的特性可以有效地利用到其它物种上来增加产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜MADS-box基因CsMADS09过表达载体及其应用。
技术介绍
MADS-box基因是一类序列特异的调节基因家族，它所编码的MADS-box蛋白因子为转录因子，其主要功能是激活或抑制基因的转录反应。MADS-box转录因子是通过二聚体的形式以其保守结构域与特定的DNA序列相结合来调控基因的表达。在植物中，MADS-box基因的分布几乎遍布整个植物界，除在双子叶植物拟南芥、金鱼草、葡萄、矮牵牛和杨树等植物中广泛存在外，在单子叶的水稻、玉米、小麦、高粱等中也大量分布。MADS-box基因一般以基因家族的形式存在，在植物生长发育不同阶段如苗期、花期、在植物的不同部位，如营养器官根、茎、叶和生殖器官花、果实、种子中MADS-box基因都有不同程度的表达，并在其中起重要的调控作用。MADS-box基因最显著的作用是参与花器官的形态建成。研究表明，双子叶拟南芥花器官的发育可以归纳为花发育的ABCDE模型。该模型认为，花器官是A、B、C、D和E五类基因共同表达的结果，这五类基因基本上都为MADS-box基因。A类基因(APETALA1,AP1；APETALA2,AP2)单独决定萼片，A类基因和B类基因(APETALA3,AP3;PISTILLATA,PI)共同决定花瓣，B类基因和C类基因(AGAMOUS,AG)共同决定雄蕊，C类基因单独决定心皮，同时，C基因还参与分生组织决定性的调控。D类基因SEEDSTICK（STK）的功能与C基因部分重叠，影响胚珠的发育。E基因SEPALLATA1-SEPALLATA4（SEP1-SEP4）在全局上对花瓣、雄蕊和雌蕊进行调控。MADS-box基因还参与其它生长发育过程，在拟南芥中分离出了与开花早晚相关的AGL20、AGL24、COSANS、SOC1、FLC、FLM、FRI和SVP等。在番茄中分离出一个与其成熟相关的MADS基因LeMADS-RIN，在香蕉中分离出一个在香蕉后熟过程中起重要作用的MuMADS1基因。耧斗菜的FRUITFULL-like参与叶的发育，胡椒的CaJOINTLESS基因可以抑制茎的分生组织的生长。MADS-box基因通常以基因家族的形式存在，目前仅对极少部分的成员进行克隆的功能的鉴定分析，大多数的成员需要进行深入的研究，这也暗示MADS-box可能还参与许多我们还不清楚的发育和调控过程。黄瓜属葫芦科植物，广泛分布于中国各地，为主要的温室产品之一。2009年黄瓜基因组测序的完成为从分子水平上研究黄瓜基因的相关功能提供了可能。MADS-box基因在植物的各个生长发育阶段起着重要的作用，但其在黄瓜中的功能还知之甚少，值得进一步的研究。我们的研究发现，黄瓜中的CsMADS09基因的过量表达的拟南芥顶端的果荚数明显增加，利用这一特性可运用到其它物种上来增加产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种黄瓜CsMADS09基因花特异表达载体及及其增加果荚数量中的应用，该载体含有黄瓜CsMADS09，基因的上游连有双35S启动子。本专利技术的上述植物表达载体为PHB-CsMADS09，由下述方法构建而成：（1）根据CuGI（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）上公布的黄瓜CsMADS09的序列（Csa013130），设计两端引物：CsMADS09-F：5’-aaaaAAGCTTATGGGAAGAGGTAGGGTTCA-3’（含HindIII位点）CsMADS09-R：5’-aaaaTCTAGATTACCCAATGTTTAGAGAGG-3’（含XbaI位点）。以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsMADS09全长。（2）回收CsMADS09的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsMADS09。（3）使用HindIII和XbaI酶切pMD18-CsMADS09，回收CsMADS09片段，同时用HindIII和XbaI酶切PHB，回收后连接，转化感受态细胞，获得植物表达载体PHB-CsMADS09。本专利技术的另一目的是公开黄瓜CsMADS09在遗传改良中的基因工程应用，该基因导入拟南芥后，获得的CsMADS09转基因植株的果荚数量增加，萼片膨大卷曲、萼片异生出类似柱头状的器官，可以应用在生产实践中改造花卉的形状和提高作物的产量。附图说明图1为本专利技术中CsMADS09全长扩增后的电泳示意图；图2为本专利技术表达载体PHB-CsMADS09的HindIII和XbaI双酶切电泳检测图；图3为转基因植株的PCR鉴定图；图4为过量表达CsMADS09的转基因拟南芥植株的表达分析，其中A为野生型；B-C为转基因植株株系。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本专利技术，而不对本专利技术的范围构成任何限制。实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRIzoLReagentRNA提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于TOYOBO公司，DNaseⅠ购于天根生化科技（北京）有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。本专利技术实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例１：表达载体PHB-CsMADS09的构建(1)引物设计：根据CuGI（http://cucumber.genomics.org.cn/page/cucumber/index.jsp）上公布的黄瓜CsMADS09的序列（Csa013130），设计两端引物：CsMADS09-F：5’-aaaaAAGCTTATGGGAAGAGGTAGGGTTCA-3’（含HindIII位点）CsMADS09-R：5’-aaaaTCTAGATTACCCAATGTTTAGAGAGG-3’（含XbaI位点）。（2）黄瓜花蕾总RNA的提取所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7mm的花蕾1mg，取材后立刻冻到液氨中，采用TRIzol（Invitrogen，USA）试剂法提取总RN本文档来自技高网...
【技术保护点】
具有黄瓜CsMADS09基因的表达载体，其特征在于：该表达载体含有黄瓜CsMADS09的编码区全长、双35启动子，所述CsMADS09基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
【技术特征摘要】
1.具有黄瓜CsMADS09基因的表达载体，其特征在于：该表达载体含有黄瓜CsMADS09的
编码区全长、双35启动子，所述CsMADS09基因的核苷酸序...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘世强，胡丽芳，蒋伦伟，杨寅桂，王义华，黄长干，
申请(专利权)人：江西农业大学，
类型：发明
国别省市：江西;36
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。