一种番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法技术

本发明专利技术公开了一种番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其包括：1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-1和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物电泳检测；4)对待测番茄样品中是否含有Ty-1基因和ty-5基因进行鉴定等步骤。本发明专利技术用于快速鉴定番茄材料中是否含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-1和ty-5。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法。
技术介绍
番茄是一种重要的蔬菜作物，近年来受到番茄黄化曲叶病毒(Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)病的危害，使我国番茄产业的发展受到了严重的影响。该病害由携带番茄黄化叶病毒的烟粉虱进行传播，由于栽培番茄中起初都不含有抗病基因，植株被TYLCV侵染后，生长受到严重抑制，易落花落果。如果苗期感病，危害严重时，甚至造成绝产绝收，对番茄生产造成了巨大的影响。而在野生番茄中发现的抗TYLCV基因，经过鉴定发现，对该病具有很好的抗性。已知的番茄抗TYLCV基因有，Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a，Ty-4，Ty-5和Ty-6。在我国的番茄品种中应用较多的抗病基因是Ty-1，Ty-2，Ty-3，Ty-3a。而Ty-1、Ty-3和Ty-3a为等位基因，因此目前被利用到番茄品种中的抗病基因非常有限。再加上TYLCV变异性强，长期使用现有抗原容易使病毒突破抗病基因的抗性。在番茄抗TYLCV育种过程中，选育含有新的抗原基因的材料，并将多个抗TYLCV基因进行聚合，可以显著的增强品种的抗性水平。但在对这些基因进行聚合育种的过程中，分离群体抗性鉴定后，所获得的抗TYLCV植株无法确定其中含有的是哪个抗性基因。利用分子标记的手段，可以对鉴定后抗性材料中的抗病基因进行标记确定，甚至可以不通过抗性鉴定，就能判断植株中所含的是哪个抗病基因，加快了对育种材料的选择，缩短了育种的进程。目前，Ty-1基因被定位在番茄6号染色体长臂端，标记Ty1与该基因连锁。图位克隆确定该基因与Ty-3为等位基因，均为RNA依赖性的RNA聚合酶。ty-5基因被定位在番茄4号染色体上，与CAPS标记SlNAC1连锁，该标记也是目前已知的唯一与ty-5连锁的分子标记。虽然利用Ty-1和ty-5的分子标记进行辅助选择可以加快对含有基因材料的筛选，但是需要进行两轮PCR检测才能完成对材料的筛选，如果可以建立这两个基因的多重PCR体系，可以在原来的基础上将工作效率提高一倍，鉴定成本减少一半，更加有利于对抗病基因的筛选。但目前的Ty-1基因的连锁标记经过分析后，由于标记类型和内切酶的差异，均无法与ty-5基因建立多重PCR体系。
技术实现思路
为克服现有技术的缺陷，本专利技术的目的在于提供一种番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，用于快速鉴定番茄材料中是否含有番茄黄化曲叶病抗性基因Ty-1和ty-5。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下：一种番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其包括以下步骤：1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-1和ty-5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物电泳检测；4)对待测番茄样品中是否含有Ty-1基因和ty-5基因进行鉴定。进一步的方案，本专利技术所述的步骤1)中的番茄叶取自育种、野生、分离群体番茄品种的番茄叶。进一步的方案，本专利技术所述的步骤2)中，Ty-1引物为：Ty1-F:CAACAGCAATGTACCTGGTCAGTy1-R:CTGTGGCATACGTTGGTGACAC；ty-5引物为：ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGCty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC。进一步的方案，本专利技术所述的步骤2)中，多重PCR反应体系为：10ng/μL模板DNA2μL，4pmmol/L的引物Ty1-F/R与ty5-17R/F各0.3μL，mix酶10μL，双蒸水或三蒸水加至20μL；多重PCR反应条件为：95℃预变性3min；每个循环95℃变性45sec，54℃退火45sec，72℃延伸45sec，共38个循环，最后72℃延伸10min。进一步的方案，本专利技术所述的步骤3)中，电泳采用8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳的具体步骤包括：a)制备聚丙烯酰胺凝胶：KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水清洗干净，最后用双蒸水冲洗，晾干后用乙醇擦拭长短板；然后将长板处理面向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支架，短板向里固定，即凹口板面向电泳液方向，用1％的琼脂糖密封橡胶条与玻璃板之间的缝隙；在30％的丙烯酰胺溶液加入10×TBE、双蒸水、TEMED以及10％的APS配置成8％的聚丙烯酰胺溶液；然后将电泳槽倾斜30度，缓缓地使聚丙烯酰胺溶液倒入两板间，等胶溶液快要溢出时，把玻璃板放平，用薄塑料板赶气泡，倒插梳子；灌完胶后，放于室温让其自然凝固，观察胶边沿出现折射线就表明胶已凝固；b)聚丙烯酰胺凝胶电泳：向电泳仪下端槽内倒1xTB，向上槽倒1×TBE，使液面高于短板上沿，拔出梳子，并用注射器吸取适量电泳液把点样孔洗干净；取PCR产物上样；调节电压160V，电泳1.5-2.0h，电泳完毕；c)聚丙烯酰胺凝胶电泳的显色：把经冷却的胶板置于盛有固定液的塑料盘中，摇床震荡3-8min；然后将胶板置于盛有染色液的塑料盘中，摇床震荡10-15min；经染色的胶板用双蒸水清洗，然后用添加了浓度为10％的Na2S2O3的双蒸水清洗；将清洗干净的胶板置于显色液中显色，至DNA条带清晰后将显色完毕的胶板放回固定液中反应，反应完成后用双蒸水清洗，然后用保鲜膜密封，置于室温自然干燥，条带统计、拍照留存。进一步的方案，本专利技术所述的固定液由0.5％乙酸2.5mL、10％乙醇50mL、双蒸水450mL组成；所述染色液由硝酸银与双蒸水组成，其中硝酸银与双蒸水的质量比为1:500。进一步的方案，本专利技术所述的所述显色液由7.5gNaOH、37％-40％的甲醛1.5mL、双蒸水500mL组成。进一步的方案，本专利技术所述的步骤4)中，对待测样品中Ty-1基因和ty-5基因进行鉴定方法具体步骤为：在步骤3)酶切后的多态性条带中大找出750bp和172bp条带，即分别对应Ty-1基因和ty-5基因。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术所述番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法中，PCR体系采用扩增ty-5基因的ty5-17引物与SLNACI相比，酶切位点减少，反应体系稳定性更高；2.本专利技术所述的番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法同时检测ty-5和Ty-1体系的建立，加快了对分子标记辅助选择的进程，缩短了育种周期，降低了育种成本；3.本专利技术所述的番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法克服了对两个基因分离群体进行抗性鉴定后无法确定含有哪个抗病基因的困扰；4.本专利技术所述的番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法可降低生产过程中化学农药的施用，减轻病害的传播流行，节约生产成本，保障番茄生产的顺利开展，提高番茄产业的经济效益。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种番茄Ty‑1基因和ty‑5基因的多重PCR检测方法，其特征在于，其包括以下步骤：1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty‑1和ty‑5的引物，通过建立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；3)PCR产物电泳检测；4)对待测番茄样品中是否含有Ty‑1基因和ty‑5基因进行鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种番茄Ty-1基因和ty-5基因的多重PCR检测方法，其特征在于，其包括
以下步骤：
1)从番茄叶中提取待检测番茄叶片DNA；
2)以上述番茄叶片提取获得的DNA为模板，利用Ty-1和ty-5的引物，通过建
立的多重PCR反应体系，对待测样品进行多重PCR扩增；
3)PCR产物电泳检测；
4)对待测番茄样品中是否含有Ty-1基因和ty-5基因进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤1)中的番
茄叶取自育种、野生、分离群体番茄品种的番茄叶。
3.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，
Ty-1引物为：
Ty1-F:CAACAGCAATGTACCTGGTCAG
Ty1-R:CTGTGGCATACGTTGGTGACAC；
ty-5引物为：
ty5-17R：TAACAAAGCCCTCAAAGC
ty5-17F：GTCTCCGAAACGTAATCC。
4.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤2)中，多
重PCR反应体系为：
10ng/μL模板DNA2μL，
4pmmol/L的引物Ty1-F/R与ty5-17R/F各0.3μL，
mix酶10μL，
双蒸水或三蒸水加至20μL；
多重PCR反应条件为：95℃预变性3min；每个循环95℃变性45sec，54℃
退火45sec，72℃延伸45sec，共38个循环，最后72℃延伸10min。
5.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于，步骤3)电泳采
用8％的聚丙烯酰胺凝胶，电泳的具体步骤包括：
a)制备聚丙烯酰胺凝胶：KOH溶液浸泡玻璃板一定时间，用去污剂和清水
清洗干净，最后用双蒸水冲洗，晾干后用乙醇擦拭长短板；然后将长板处理面
向上，短板处理面向下盖到长板上，用橡胶条固定两个板，插入垂直电泳仪支
架，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王银磊，赵统敏，余文贵，赵丽萍，杨玛丽，姜静，李亚茹，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32