用于细胞色素P450单加氧酶生物催化的全细胞系统技术方案

本发明专利技术的主题是用于将真核细胞来源的细胞色素P450单加氧酶的底物转化为有价值的生物技术产物的全细胞催化方法。本发明专利技术的主题还在于经遗传工程改造从而以高比率实现那些生物转化的微生物以及制备这些微生物菌株的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术的主题是用于将真核细胞来源的细胞色素P450单加氧酶的底物转化为有价值的生物技术产物的全细胞催化方法。本专利技术的主题还在于经遗传工程改造从而以高比率实现那些生物转化的微生物以及制备这些微生物菌株的方法。专利技术背景细胞色素P450单加氧酶(P450)在多种疏水化合物的代谢中起重要作用。它们涉及甾体、脂肪酸、维生素的合成和其他生物过程像外源物(xenobiotics)的解毒(Maurer等，2003；UrlacheretGirhard，2012)。P450催化多种多样的反应包括羟基化、N-氧化、N-，O-和S-脱烷基化、磺氧化、脱氨基、脱硫、脱卤、过氧化、N-氧化物还原、重排反应、C-C和C-O酚偶联、C-C键的裂解及其他(Bernhardt等，1996；Bernhardt等，2006；)。P450催化大量底物的区域特异性、化学特异性和立体特异性氧化的能力反映了它们的生物学作用并使它们成为生物技术应用的重要候选者。具体地，甾体激素广泛地用作抗炎、避孕和抗增殖药物。在哺乳动物中，这些甾体的合成以胆固醇变为孕烯醇酮的侧链切割反应开始。孕烯醇酮充当产生另外的甾体激素如氢化可的松的基础(Szczebara等，2003)，而且巨大的利益/兴趣与其从低价底物(如胆固醇及其植物来源的类似物)的工业大规模转化相关。然而，胆固醇变为孕烯醇酮的侧链切割反应是甾体总体工艺中的限制步骤。在哺乳动物中，它被使用皮质铁氧还蛋白(adrenodoxin)和皮质铁氧还蛋白还原酶作为电子载体的膜结合CYP11A1酶催化。已花费了巨大的努力以在重组微生物如大肠杆菌(Escherichiacoli)中重建甾醇侧链切割酶系统(Sakamoto等.，EP2386634)，但是获得满意水平的酶活性仍然是困难的，主要因为如下事实：哺乳动物来源的CYP11A1是不溶的膜相关酶而且CYP11A1看起来不能在原核细胞宿主中正确折叠。已证明巨大芽孢杆菌DSM319的无质粒衍生物是一种用于共表达来自巨大芽孢杆菌ATCC13368的原核细胞细胞色素P450CYP106A2和牛皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)和皮质铁氧还蛋白(Adx)的有价值的宿主；它已被应用于具有萜结构的疏水酸(如抗炎性五环三萜11酮-β乳香酸(KBA))的全细胞转化。在此工作中，与天然表达CYP106A2的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)菌株ATCC13368和大肠杆菌全细胞系统相比研究了重组的巨大芽孢杆菌系统。来自巨大芽孢杆菌ATCC13368的原核细胞的细胞色素P450CYP106A2是仅有的几种克隆的细菌甾体羟化酶之一。它近来被鉴定为首次报道的细菌P450二萜羟化酶，其能够进行枞酸(abieticacid)的一步法区域选择性烯丙基羟化(Bleif等2012)。然而，仍然需要这样的微生物，其作为全细胞催化剂允许以高比率表达和催化底物由真核细胞来源的细胞色素P450单加氧酶的生物转化，如胆固醇通过不溶的CYP11A1变为孕烯醇酮的侧链切割反应。
技术实现思路
令人惊奇地，本专利技术人已发现：通过使用微生物作为全细胞催化剂和通过增加其依赖于聚羟基脂肪酸酯颗粒的贮存能力，表达和催化底物由真核细胞来源的细胞色素P450单加氧酶以高比率的生物转化是可能的。特别地，本专利技术人通过在巨大芽孢杆菌MS941中共表达牛来源的不溶性CYP11A1、牛皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)和牛皮质铁氧还蛋白(Adx)实现了胆固醇、胆固醇类似物和衍生物高比率转化为孕烯醇酮、羟化的胆固醇类似物和开环甾类化合物(secosteroids)。因此，本专利技术的第一方面是遗传工程改造的微生物，其能够将胆固醇、胆固醇类似物及其衍生物转化为甾体激素前体或衍生物，其中所述微生物包含至少一个编码真核细胞来源的细胞色素P450的DNA序列、编码Adx的外源DNA序列和编码AdR的外源DNA序列。本专利技术的第二方面是用于产生甾体激素前体的方法，其包括如下步骤：-提供如上所述的微生物，-在允许表达所述外源DNA序列的条件下培养所述微生物，-将所述微生物培养物与选自下组的底物接触：胆固醇、胆固醇类似物和衍生物，和-回收甾体激素前体或衍生物。本专利技术的第三方面是制备重组菌株的方法，其在将胆固醇、胆固醇类似物和衍生物转化为甾体激素前体或衍生物方面得到改进，其包括如下步骤：-提供微生物，-通过遗传工程技术向所述微生物引入至少一个编码真核细胞来源的细胞色素P450的DNA序列、编码Adx的外源DNA序列和编码AdR的外源DNA序列。本专利技术的第四方面是用于增加微生物对于疏水或亲水化合物的贮存能力的方法，其包括如下步骤：-提供包含功能性内源聚合酶系统的微生物，所述功能性内源聚合酶系统能构造聚羟基脂肪酸酯体(PHA-体)；和-通过遗传工程技术在所述微生物中调控涉及构造PHA体的至少一个基因的表达，由此获得具有对于疏水或亲水化合物的贮存能力增加的微生物。所公开的微生物和方法的这些和其他特征和优势会从如下详细描述连同所附的权利要求书中得到更加全面的理解。专利技术详述1.根据本专利技术经遗传工程改造的微生物令人惊奇地，本专利技术人已发现：通过使用微生物作为全细胞催化剂表达和催化底物由真核细胞来源的细胞色素P450单加氧酶以高比率的生物转化是可能的。特别地，本专利技术人通过在巨大芽孢杆菌MS941中共表达牛来源的不溶性CYP11A1、牛皮质铁氧还蛋白还原酶(AdR)和牛皮质铁氧还蛋白(Adx)实现了胆固醇、胆固醇类似物和衍生物高比率转化为孕烯醇酮，如实施例2和附图2-12所述。因此，本专利技术涉及经遗传工程改造的微生物，其能够将胆固醇、胆固醇类似物和其衍生物转化为甾体激素前体，其中所述微生物包含至少一个编码真核细胞来源的细胞色素P450的DNA序列、编码Adx的外源DNA序列和编码AdR的外源DNA序列。“经遗传工程改造的”微生物意指根据本专利技术的任何微生物，其已经由本领域技术人员通过本领域已知的遗传工程技术进行修饰。除非另外指示，那些技术是生物信息学、细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学领域常规的技术，其在本领域的技术之内。所述技术在文献中充分地解释。参见，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学实验指南)(FrederickM.AUSUBEL，2000，WileyandsonInc，LibraryofCongress，USA)；MolecularCloning：ALaboratoryManua本文档来自技高网...

【技术保护点】
能将胆固醇、胆固醇类似物和衍生物转化为甾体激素前体的经遗传工程改造的微生物，其中所述微生物包含至少一个编码真核细胞来源的细胞色素P450的DNA序列、编码Adx的外源DNA序列和编码AdR的外源DNA序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.17 EP 13305814.91.能将胆固醇、胆固醇类似物和衍生物转化为甾体激素前体的经遗传工程改造的微生
物，其中所述微生物包含至少一个编码真核细胞来源的细胞色素P450的DNA序列、编码Adx
的外源DNA序列和编码AdR的外源DNA序列。
2.根据权利要求1的经遗传工程改造的微生物，其中所述真核细胞来源的细胞色素
P450选自下组：CYP11A1、CYP17A1、CYP11B1、CYP11B2、CYP3A4、CYP46A1、CYP27A1、CYP21A1和
CYP21A2。
3.根据权利要求1或权利要求2的经遗传工程改造的微生物，其中已将所述外源DNA序
列通过遗传工程技术引入所述微生物。
4.根据权利要求3的经遗传工程改造的微生物，其中所述微生物已用至少一个包含所
述外源DNA序列的质粒转化。
5.根据权利要求1-4中任一项的经遗传工程改造的微生物，其中将所述外源DNA序列整
合入所述微生物的基因组。
6.根据权利要求1-5中任一项的经遗传工程改造的微生物，其中所述微生物还包含功
能性内源聚合酶系统，其能构造聚羟基脂肪酸酯体。
7.根据权利要求1-6中任一项的经遗传工程改造的微生物，其中所述微生物是巨大芽
孢杆菌(Bacillusmegaterium)。
8.根据权利要求7的经遗传工程改造的微生物，其中所述微生物是巨大芽孢杆菌MS941
菌株。
9.根据权利要求1-8中任一项的经遗传工程改造的微生物，其中涉及构造聚羟基脂肪
酸酯体的至少一个基因的表达被调控。
10.一种用于产生甾体激素前体的方法，包括如下步骤：
a.提供根据权利要求1-9中任一项的微生物，
b.在允许表达所述外源DNA序列的条件下培养所述微生物，
c.将所述微生物培养物与选自下组的底物接触：胆固醇、胆固醇类似物和衍生物，和
d.回收甾体激素前体。
11.根据权利要求10的方法，其中：
a.所述底物选自下组：胆固醇、油菜甾醇(campesterol)、麦角二烷醇
(ergostadienol)、脱氢胆固醇(desmosterol)、β...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·盖尔巴，F·汉内曼，S·布莱夫，M·克勒塞尔，R·本哈特，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国;FR