猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术适用于病毒检测试剂盒技术领域，提供了一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针，该检测方法使用实时荧光PCR法进行检测。本发明专利技术猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法与现有技术比较，能够一步同时实现对猪瘟病毒野毒株和疫苗株的分型检测，且具有灵敏度高、特异性强、周期短、准确度高等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病毒检测试剂盒
，尤其涉及一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用，其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，如图1所示，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。猪瘟病毒(Hogcholeravirus,Swinefevervirus)是ssRNA病毒，黄病毒科瘟病毒属，其RNA为单股正链。猪瘟病毒主要危害猪(包括野猪)，其他动物不发病。猪瘟是一种急性、热性、高度接触性传染病，主要特征是高温、微血管变性而引起全身出血、坏死、梗塞。猪瘟对猪危害极为严重，会造成养猪业重大损失。猪瘟病毒兔化疫苗株是使用猪瘟病毒强毒株反复感染钝感动物家兔，通过传代使其毒力减弱而获得适应兔体的毒株，由此制成的疫苗。猪瘟病毒兔化疫苗株已被广泛应用于各国的养猪产业，为控制猪瘟起到了重要的作用。但同时，如何区分感染猪瘟病毒的猪和接种了兔化疫苗株的猪也成了行业内一大难题。传统的猪瘟病毒检测方法是病毒毒分离培养和ELISA为代表的血清学的检测，但在检测猪瘟野毒株和疫苗株时，检测结果毫无差别。基因检测可以作为区分野毒株和疫苗株的方案。现今广泛使用的方案是对猪瘟病毒基因组5’UTR区域进行序列分析，5’UTR兔化疫苗株和野毒株碱基序列分别为：5’UTR兔化疫苗株：GGACTAGCAAAACGGAGGGACTAGC；5’UTR野毒株：GGACTAGCAAACGGAGGGACTAGC；5’UTR兔化疫苗株比野毒株多一个碱基A，在设计引物对5’UTR区域进行扩增后通过序列分析可以有效的区分野毒株和疫苗株。现有区分野毒株和疫苗株猪瘟病毒的方法通常有一下几种：1)PCR-测序：设计引物将猪瘟病毒5’UTR区域进行PCR扩增，并将产物进行测序，从而区分；2)PCR-溶解曲线分析：使用荧光染料法(SYBRgreen)对猪瘟病毒5’UTR区域进行Real-timePCR扩增检测，实时荧光PCR结果呈阳性后对产物进行溶解曲线分析，根据解链温度的不同来区分野毒株和疫苗株；3)PCR-Taqman探针法：根据突变区域，设计两条不同标记的Taqmen探针，分别和野毒株、疫苗株完全互补，然后优化荧光PCR体系分辨率至足以区分野毒株和疫苗株。然而，PCR-测序法操作步骤繁琐，成本高，很难作为常规检测使用；PCR-溶解曲线法分辨率低，单碱基突变再溶解曲线结果上判断偏主观，而且对仪器要求较高，市面上大部分仪器不适用；PCR-Taqman探针法对扩增体系的分辨率优化要求较高，且当样本浓度较低时，对结果的判断也偏主观。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，旨在解决现有技术不能高效、准确区分野毒株和疫苗株猪瘟病毒的问题。本专利技术的另一目的在于提供一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法。本专利技术是这样实现的，一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针；所述猪瘟病毒5’UTR引物包括：猪瘟病毒5’UTR上游引物：5’-GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3’；猪瘟病毒5’UTR下游引物：5’-TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’；所述DNA/RNA杂合探针包括：所述野毒株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTGC-3’；所述疫苗株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTTGC-3’。以及，一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法，该方法使用上述猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒进行检测，包括以下步骤：样本RNA提取；RT-PCR一步法检测；结果判断；其中，所述实时荧光PCR检测的参数设置为：42-50℃：10-15min；92-95℃：2-3min；92-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S；40个循环。本专利技术提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒及其检测方法，采用特异性设计的引物和DNA/RNA杂合探针，使用实时荧光PCR法进行检测，能够一步同时实现对猪瘟病毒野毒株和疫苗株的分型检测。与免疫法猪瘟病毒检测试剂相比具有可分型检测，本专利技术具有操作简单、安全等优点，可快速排除疫苗株对检测结果的影响。此外，所述试剂检测盒与其他分子检测试剂相比，具有快速、灵敏和方便等优点，可应用于猪瘟病毒的检测。附图说明图1是提供的实时荧光定量PCR扩增曲线示意图；图2是本专利技术实施例提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法示意图；图3是本专利技术实施例提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测方法阳性结果和阴性结果示意图；图4是本专利技术实施例1提供的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法扩增图谱；图5是本专利技术对比例1提供的猪瘟病毒荧光PCR法扩增图谱。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例中，对下述名词作出如下解释。聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)：是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。实时荧光PCR法：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性定量分析的方法。逆转录PCR(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR)：是反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增目的片段。RT-PCR包括两步：1、mRNA逆转录为cDNA；2、以cDNA为模版进行PCR。将这两个步骤合二为一个反应管进行即为一步法，将两个步骤分开两管反应为两步法。一步法更方便本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探针；所述猪瘟病毒5’UTR引物包括：猪瘟病毒5’UTR上游引物：5’‑GGGCTAGCCATGCCCATAGTA‑3’；猪瘟病毒5’UTR下游引物：5’‑TTCGACGTGAGCAGAAGCC‑3’；所述DNA/RNA杂合探针包括：所述野毒株DNA/RNA杂合探针：5’‑AGTCCCTCCGTTTGC‑3’；所述疫苗株DNA/RNA杂合探针：5’‑AGTCCCTCCGTTTTGC‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特征在于，包括
PCR反应液，所述PCR反应液包括猪瘟病毒5’UTR引物和DNA/RNA杂合探
针；
所述猪瘟病毒5’UTR引物包括：
猪瘟病毒5’UTR上游引物：5’-GGGCTAGCCATGCCCATAGTA-3’；
猪瘟病毒5’UTR下游引物：5’-TTCGACGTGAGCAGAAGCC-3’；
所述DNA/RNA杂合探针包括：
所述野毒株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTGC-3’；
所述疫苗株DNA/RNA杂合探针：5’-AGTCCCTCCGTTTTGC-3’。
2.如权利要求1所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特
征在于，所述DNA/RNA杂合探针为采用不同荧光标记物进行编码标记的
DNA/RNA杂合探针，包括：
所述野毒株DNA/RNA杂合探针：
5’-FAM-AGTCCCTCCGTTTGC-DABCYL-3’；
所述疫苗株DNA/RNA杂合探针：
5’-HEX-AGTCCCTCCGTTTTGC-DABCYL-3’。
3.如权利要求1所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特
征在于，所述PCR反应液还包括M-MLV逆转录酶、Taq酶、dNTPs、不含镁
离子的缓冲液、氯化镁、溴酚蓝、RnaseH。
4.如权利要求3所述的猪瘟病毒DNA/RNA杂合探针法检测试剂盒，其特
征在于，所述溴酚蓝、M-MLV逆转录酶、Taq酶、RnaseH与所述不含...

【专利技术属性】
技术研发人员：田仁鹏，吴成贡，王茵茵，邓春兴，
申请(专利权)人：深圳市生科源技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44