本发明专利技术公开了一种酸性脲酶结构基因及其表达和应用。本发明专利技术是将来源于普罗维登斯菌JN-B815(已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326)的脲酶结构基因ureABC连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上，然后将重组质粒pET-28a-ureABC导入E.coli BL21(DE3)。用此重组菌能表达含有结构亚基的可溶性酸性脲酶。经镍柱纯化后，此脲酶体现出与原始菌中提取的酸性脲酶具有相同的性质，同时体现出脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种酸性脲酶，特别是一种酸性双功能脲酶基因，属于生物工程
技术介绍
氨基甲酸乙酯(EC)是一种广泛存在于发酵食品和酒精饮料中，自然生成的具有致癌性的物质，由乙醇和尿素反应产生。由于氨基甲酸乙酯的致癌性，严格控制食品及酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量已经备受关注。尿素作为产生氨基甲酸乙酯的前体物质，主要由发酵过程中精氨酸代谢产生。因此，从去除尿素的水平来控制酒精饮料中氨基甲酸乙酯的含量是一种比较可行的方案。目前，通过向酒精饮料中添加适量脲酶以酶解法的方式去除尿素被视作最具高效性和特异性的方法。尽管有许多被认知的细菌脲酶和植物脲酶已经被广泛研究，但由于其最适pH均在中性或碱性，大多数脲酶在实际应用中均受到限制。并且，我国出口黄酒中所用脲酶均为日本进口，国际上关于氨基甲酸乙酯降解酶的报道也较少。因此，表达和生产一种酒用酸性脲酶(最适pH2-5，乙醇耐受性达10％-20％)用以提升我国酿酒业的品质以及拓展国际市场具有重要意义。本专利技术中重组大肠杆菌所表达的可溶性脲酶，虽只具有脲酶的结构亚基，但体现出与原始菌产酸性脲酶具有相同的双功能酶性质，表现出能同时分解尿素及氨基甲酸乙酯的特性。这一特性使得酸性脲酶对于黄酒中EC含量的控制具有双重作用。进而能进一步降低黄酒中EC的含量，为将来此类双功能酶在黄酒中的应用奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的提供一种新的双功能脲酶基因核苷酸序列如下所述：1)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；2)在SEQIDNO.1基础上进行过缺失、突变修饰，同源率高于90％，且具有脲酶及氨基甲酸乙酯降解酶功能的核苷酸序列。含有权利要求1所述脲酶结构基因的基因工程菌、表达载体或克隆载体均属于本专利技术要求保护的范围。所述普罗维登斯菌JN-B815由本实验室筛选，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCCNo.8326。本专利技术的第二个目的是提供重组E.coliBL21(DE3)诱导表达可溶性脲酶的方法。本专利技术的第五个目的是脲酶在黄酒中的应用。本专利技术技术方案：一种胞内表达来源于普罗维登斯菌JN-B815酸性脲酶的重组E.coliBL21(DE3)的构建方法，是将来源于普罗维登斯菌JN-B815的酸性脲酶结构基因ureABC导入E.coliBL21(DE3)中得到基因工程菌。利用构建好的工程菌发酵制备含有结构亚基的可溶性脲酶，并对酸性脲酶进行纯化。克隆方法可以采用化学合成法或PCR方法，本实验以PCR方法为例，但不限于PCR方法，具体步骤为：(1)用酸性脲酶结构基因序列设计一对引物Fs、Rs，以普罗维登斯菌JN-B815基因组为模板扩增出目的基因ureABC：Fs：CCGGAATTCATGCAATTAACCCCAAGGGAAATTGAA(EcoRⅠ)；Rs：ACGCGTCGACTTAACCAAAGAAATAACGTTGGTTCAT(SalⅠ)；下划线表示酶切位点碱基序列。(2)将目的基因ureABC连接至pET-28a载体上，获得重组载体pET-28a-ureABC,转化E.coliJM109涂布于含有卡那抗性的LB固体平板上，培养12h，挑取阳性转化子接种于含卡那霉素的LB液体培养基中培养12h，提取质粒，进行双酶切验证。验证正确的重组载体送往上海生工进行测序。(3)将重组载体转化E.coliBL21(DE3)，获得重组E.coliBL21(DE3)。并以1％的接种量接种于50mL的LB中，其中含卡那霉素50μg/mL，37℃、200rpm培养至OD600值0.8～1.0之间，加入IPTG至终浓度0.5mM，25℃、200rpm培养10h。(4)将所得发酵液10000rpm离心10min，弃上清，细胞沉淀用10mL25mMpH7.0的柠檬酸(pH4.5)缓冲液重新悬浮，超声破碎后，离心收集上清，获得脲酶粗酶液。(5)将步骤4)中所得粗酶用镍柱亲和层析进行纯化。流动相A为含20mM咪唑的柠檬酸缓冲液，流动相B为含500mM咪唑的柠檬酸缓冲液。所述酸性脲酶基因来源于对本实验室筛选菌株普罗维登斯菌JN-B815提取基因组进行克隆。酸性脲酶结构基因ureABC如SEQIDNO.1。所述表达菌株为大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。所获得结构亚基基因表达脲酶的粗酶液经镍柱亲和层析进行分离纯化，获得电泳纯的酸性脲酶。经纯化所得可溶性酸性脲酶，体现出与原始酶相同的双功能酶活性。且脲酶与EC降解酶活性比保持原酶一致，约为3:1。脲酶比酶活为2.1U/mg，氨基甲酸乙酯降解酶比酶活为0.6U/mg。脲酶酶活及氨基甲酸乙酯降解酶酶活均测于pH为4.5的柠檬酸缓冲液条件下。经发酵条件优化，可溶性脲酶最高产量达0.69U/mL，氨基甲酸乙酯降解酶酶活达0.22U/mL。所用实验室模拟黄酒以先向柠檬酸缓冲液pH4.5中加无水乙醇至体积分数为16％，后添加尿素至终浓度50mg·L-1，配制而成。模拟黄酒中尿素含量测定方法：二乙酰一肟法。酶活测定方法：采用靛酚蓝反应(Berthelotreaction)比色法酶活定义：在常压，37℃，pH4.5条件下，每分钟分解底物尿素或氨基甲酸乙酯产生1μmol氨为1个酶活力单位。其中，尿素降解酶和氨基甲酸乙酯降解酶活力的测定分别采用尿素和氨基甲酸乙酯作为底物。本专利技术的有益效果：成功的构建了一种能可溶性表达结构亚基脲酶的重组菌，并对脲酶进行纯化。证实了该酸性脲酶同时具有氨基甲酸乙酯降解酶活性，为酸性脲酶在酒类饮料中的应用提供了优良的基础。附图说明图1阳性转化子菌落PCR电泳图(M：Marker；1、2为真阳性，其他均为假阳性)。图2重组载体双酶切电泳图(M：Marker，1：重组载体2：重组载体EcoRⅠ单酶切3：SalⅠ单酶切4：EcoRⅠ，SalⅠ双酶切)图3重组E.coliBL21(DE3)全细胞SDS-PAGE图(M：Marker，1：重组载体诱导，2：重组载体未诱导，3：pET-28a空载诱导)图4不同温度诱导重组E.coliBL21(DE3)SDS-PAGE图(M：Marker，1：：重组载体未诱导上清，2：重组载体未诱导沉淀，3：重组载体30℃诱导上清，4：重组载体30℃沉淀，5：重组载体25℃诱导上清，6：重组载体25℃诱导沉淀，7：重组载体20℃诱导上清)图5不同IPTG添加量对脲酶产量的影响图6不同诱导温度对脲酶产量的影响图7不同诱导时间对脲酶产量的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种双功能脲酶结构基因，其特征在于核苷酸序列如下所述：1)核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；2)在SEQ ID NO.1基础上进行过缺失、突变修饰，同源率高于90％，且具有脲酶及氨基甲酸乙酯降解酶功能的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
1.一种双功能脲酶结构基因，其特征在于核苷酸序列如下所述：
1)核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；
2)在SEQIDNO.1基础上进行过缺失、突变修饰，同源率高于90％，且具有脲酶及氨
基甲酸乙酯降解酶功能的核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述脲酶结构基因的基因工程菌。
3.含有权利要求1所述脲酶结构基因的表达载体或克隆载体。
4.权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌为重组E.coliBL21(DE3)。
5.权利要求4所述表达脲酶的重组E.coliBL21(DE3)的构建方法，其特征在于将权利
要求1所述脲酶结构基因ureABC导入E.coliBL21中得到一种基因工程菌；步骤为：
(1)克隆脲酶基因ureABC到表达载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-ureABC；
(2)将步骤1)中所构建的重组质粒pET-28a-ureABC送去测序；
【专利技术属性】
技术研发人员：田亚平，张迁，张智威，周楠迪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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