本发明专利技术涉及miR-26a在非小细胞肺癌中的应用。miR-26a能够有效地抑制NSCLC细胞的增殖，促进肺癌细胞的凋亡。miRNA靶基因预测软件显示，WNK3是miR-26a的潜在靶点，其3′-UTR区域存在2个与miR-26a种子序列互补配对的结合位点。经检测，miR-26a可在蛋白水平抑制靶基因的翻译表达。双荧光报告基因系统证实了miR-26a与WNK3的直接靶向关系。深入研究后我们发现，miR-26a通过靶向WNK3蛋白，开启细胞凋亡的Caspase途径，最终发挥诱导细胞凋亡的功能，为精准治疗提供了重要的治疗靶标。本发明专利技术验证了miR-26a的作用机制，在临床上提供了一种潜在的具有抑癌功能的miRNA分子，为相关药物靶点的研究提供了理论依据,以及提供了一种新颖的精准治疗研究方向、应用指导。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
肺癌是世界范围内最为常见、死亡率最高、对人群健康和生命威胁最大的恶性肿 瘤之一。肺癌可以分为小细胞肺癌（smallcelllungcancer,SCLC)和非小细胞肺癌(non smallcelllungcancer,NSCLC)。在我国，约80%的肺癌被诊断为NSCLC，它主要包括腺 癌、鳞状细胞癌、大细胞未分化癌三大类。大部分肺癌患者在患病早期并无明显症状，从而 导致确诊时间较晚，治疗效果较差，疾病预后率较低的特点。纵使治疗方法取得了巨大的发 展，NSCLC的五年生存率仍然不高于15%。 微小RNA(microRNA，miRNA)是一类能够调节细胞功能的非编码小RNA^iRNA长约 20-25个核苷酸(nucleotide，nt)，在细胞核中由双链RNA前体(pri-miRNA)经过一系列加 工形成成熟的miRNAmiRNA主要与信使RNA(messengerRNA,mRNA)的3'非翻译区（3' -UTR) 结合，通过降解mRNA或抑制mRNA翻译来发挥功能。经统计，人体内miRNA的数量占基因总数 的1%，但有10-30%的基因转录组受miRNA直接调控，约85%的基因与miRNA有关。 miRNA在很多生物进程中发挥作用，包括控制发育、胚胎生成、细胞分化增殖及凋 亡。研究表明，很多miRNA在不同肿瘤中异常表达，并在肿瘤的发生过程中扮演着重要的角 色。miRNA及其靶基因的功能在肿瘤的发生发展中非常重要，一些miRNA甚至有望成为肿瘤 治疗的基因靶点。而miRNA的表达谱可能成为肿瘤诊断、预后、个性化治疗和疾病分类的潜 在生物标记。目前肺癌中的miRNA表达一直是研究的热点之一。 目前的研究结果显示:miR-26a的细胞功能非常复杂，它在多种疾病细胞中表达异 常。例如在多形成性胶质瘤中，miR-26a靶向毛细血管扩张性共济失调症突变基因ATM，提升 细胞的辐射敏感性，发挥辐射致敏剂的作用；在胰腺导管癌和前列腺癌中，miR-26a具有抑 癌基因的功效;而在卵巢癌细胞中，miR-26a表达水平提升，能够促进肿瘤细胞的增殖和成 瘤。 本专利技术通过Solexa测序技术获得了小鼠NSCLC组织和正常组织之间的miRNA差异 表达谱，检测了miR-26a在人NSCLC癌旁和肺癌组织中的表达差异，发现miR-26a可作为潜在 的诊断标志物，为精准治疗提供了重要的实验依据和应用指导。本实践通过体外功能性实 验观察miR-26a对于细胞增殖和凋亡能力的影响，并提出了可能存在的作用机制。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供miR_26a基因在制备抑制非小细胞癌细胞增殖药物中 的应用。 本专利技术的目的之二在于提供miR_26a基因在制备加速非小细胞癌细胞凋亡药物中 应用。 本专利技术再一涉及miR-26a与WNK3之间的相互作用。在一优选实例中，本专利技术证明 miR-26a可以直接靶向结合WNK3，抑制其翻译成熟。在另一优选实例中，本专利技术证实miR-26a的抑癌作用的分子机制与WNK3部分相关。miR-26a可通过WNK3发挥其细胞功能。本专利技术的实施步骤如下所述： 第一，本专利技术根据针对小鼠诱导肺癌模型的测序结果，发现了miR-26a在正常组织与肿 瘤模型间的表达差异。为了检测miR_26a的表达量，本实践通过qRT-PCR技术，检测了miR-26a在人类NSCLC组织中的表达情况，并对常见NSCLC细胞系进行类似操作。 第二，使用miRNA模拟物mimic在NSCLC细胞中高表达miR-26a，使用CCK-8、克隆形 成实验、流式细胞术等手段检测miR-26a对于NSCLC细胞生长、增殖和凋亡等生理过程的影 响。 第三，根据靶基因在线预测软件寻找miR-26a的潜在靶基因，确定研究对象。将含 有结合位点的靶基因序列装载至pGL-3荧光报告基因载体，并根据结合位点突变部 分碱基，检测miR-26a与靶基因的调控关系。 第四，在NSCLC细胞系中高表达miRNA，检测靶基因的表达是否受miR-26a影响；在NSCLC细胞系中过表达靶蛋白，观测下游信号通路是否出现回复。 按照上述过程实施，本专利技术证实，miR-26a在NSCLC组织及细胞系中的表达量均出 现降低。功能性细胞实验显示，miR-26a能够降低肺癌细胞存活率、抑制细胞增殖、阻滞细胞 周期并促进细胞凋亡，发挥抑癌作用。分子实验显示，WNK3是miR-26a的直接靶标之一，miR-26a通过WNK3发挥促进细胞凋亡的功能。WNK3蛋白则能够抑制Caspase通路的激活与积累， 从而发挥抗凋亡的作用。 本专利技术的其余部分在下文将有详细的描述，需指出的是:上述及下文内容的各具 体特征的内容组合也在本专利技术范围之内。【附图说明】 图1miR-26a在人类NSCLC病例组织及常见NSCLC细胞系中的表达水平差异 (A)miR-26a在BEAS-2B、HCC827、A549、H1299、SPCA1、95-D细胞系中的表达量。 (B)miR-26a在24对肺癌病例组织中的表达水平变化。 图2miR_26a对NSCLC细胞增殖的影响。 (A)在H1299细胞中上调miR-26a的表达量后，活细胞增长速度变化。 (B)在A549细胞中上调miR-26a的表达量后，活细胞增长速度变化。 (C)在H1299和A549细胞中上调miR-26a后，细胞克隆形成染色示意图。 (D)在显微镜下观察细胞克隆，计算直径>1 _的细胞克隆数量。 图3miR-26a对NSCLC细胞凋亡的影响。 (A)在H1299细胞中上调miR_26a的表达量后，细胞凋亡情况变化。 (B)在A549细胞中上调miR-26a的表达量后，细胞凋亡情况变化。图4本专利技术所使用的pGL3-miReport萤光载体图谱。图5miR-26a靶向作用于WNK3的3Z-UTR。 (A)miR-26a与WNK3的结合位点及相应突变位点的示意图。 (B)在H1299细胞中高表达miR-26a后，WNK3的蛋白表达水平下降。 (C)双萤光素酶报告基因系统显示，miR-26a与WNK3的:y-UTR直接结合并发挥作 用。 图6 miR-26a通过抑制WNK3开启Caspase通路，引发细胞凋亡。 通过WesternBlot，分别检测了WNK3、Caspase-8、pr〇-Caspase_3的蛋白水平变化。【具体实施方式】 下文内容将结合具体实例进一步阐述本专利技术。这些实例仅用于阐述本专利技术，而不 用于限制本专利技术的范围。下列实例中未注明具体的实验条件或实验方法，通常按照常规条 件--即"分子克隆"（MolecularCloning:ALaboratoryManual，3rded.)中所描述的 条件，或按照制造厂商所建议的条件实施。 实施例一:确定miR_26a在小鼠诱导NSCLC组织中的表达水平变化 本专利技术所用到的基因突变型小鼠肺癌模型(L822T1、L703T2、L903T1)和正常肺癌模型(L1805)由中科院生化细胞所季宏斌教授课题组提供。L1805为小鼠正常肺部组织，L703T2 为p53-/-/Kras#的恶性肿瘤，L903T1为Lkbl-A/Kras#的恶性肿瘤，L822T1为Kr本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种miR‑26a基因制备诱导非小细胞肺癌细胞凋亡药物中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：金由辛，金言，袁天蔚，李雪，党启，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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