基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用，其中，测序文库构建方法包括：(1)在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，其中，n代表碱基C的数目；(2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目；以及(3)在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，所述扩增产物构成所述测序文库。该方法能够有效地构建单链DNA分子的测序文库，特别是微量样本的测序文库。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是基因测序领域。具体地，本专利技术涉及基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用。更具体地，本专利技术涉及基于单链DNA分子构建测 序文库的方法、用于基于单链DNA构建测序文库的装置、确定单链DNA分子的序列信息的方 法、确定RNA样本的序列信息的方法、用于确定染色质目标区域的序列信息的方法以及用 于确定基因组甲基化信息的方法。
技术介绍
二代测序技术迅猛发展，解析并鉴定了许多人类和动植物正常和致病性状的基 因，从全基因组的层面了解到前所未知的生物遗传和发育学问题。而测序前不可缺少的一 步就是构建能够适用于二代测序平台的标准样品文库，简称建库。目前主要的建库方法是 Illumia的Trueseq和Nextera系列建库方法，建库操作繁琐，并且操作过程中必须要补平 末端、加碱基A和连接接头，而这三步反应都要求在纯化后的样品体系中进行，因此每个反 应都必须进行纯化操作，而由于技术限制，纯化操作不可避免的会有一定量的样品损失，导 致这些方法的DNA起始量大，至少在纳克水平以上，并且建库过程中DNA信息大量丢失。对 于微量样品，例如珍贵稀缺的样品或者临床病人标本，传统的建库方法并不适用。因此，目 前二代测序技术在构建基因文库的方法上仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的 在于提出一种操作简单，高灵敏性，适于微量样品的基于单链DNA分子构建测序文库的方 法及其应用。 需要说明的是，本专利技术是基于专利技术人的下列工作而完成的： 专利技术人采用单链建库，利用DNA链3'端的Poly(C)n与含有Poly(6)"的延伸引物 互补配对并进行延伸反应；尽量减少通过离心柱纯化的次数，仅在扩增前进行一步纯化，并 且纯化通过磁珠与生物素亲和结合而进行的，显著减少样品损失；利用PCR反应连接接头， 并且能在添加索引标签的同时对文库样本进行扩增，扩增产物构成测序文库。 因而，根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种基于单链DNA分子构建测序文 库的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括以下步骤：（1)在单链DNA分子的3'末端形成 poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，η代表碱基C的数目，并 且η为5~30之间的整数；（2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)尾部的单链DNA分 子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3'末端包括iKGh单元，Η为碱基A、碱基T或 碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5~15之间的整数；以及（3)在所述双链DNA分子远 离iKGh单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述 扩增产物构成所述测序文库。利用根据本专利技术实施例的基于单链DNA分子构建测序文库的方法，能够有效地构 建单链DNA分子的测序文库，特别是能够有效地构建微量样本的测序文库。利用DNA链3' 端的Poly(C)n与含有Poly(G)"的延伸引物互补配对并进行单链DNA延伸反应，能避免延伸 引物互补配对到基因组DNA而不是其3'端上的情况，减小偏差的同时也保留了DNA链的特 异性，而且能应用于细胞的全基因组甲基化信息研究；并且仅进行一步纯化或不进行纯化， 显著降低多步纯化产生的样品损失和基因信息大量丢失，从而大幅减少了建库DNA的起始 量，进而能够高效、灵敏地应用于高通量测序技术，基于对测序结果的数据分析，就能够有 效地获得基因序列彳目息。 根据本专利技术的另一方面，本专利技术还提供了一种用于基于单链DNA构建测序文库的 装置。根据本专利技术的实施例，该装置包括：尾部连接单元，所述尾部连接单元用于在单链 DNA分子的3'末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中， η代表碱基C的数目，并且η为5~30之间的整数；延伸单元，所述延伸单元与所述尾部连 接单元相连，并且用于基于所述具有Poly(C)尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其 中，延伸引物在其3 '末端包括H(G) "单元，Η为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目， 并且m为5~15之间的整数；接头连接单元，所述接头连接单元与所述延伸单元相连，并且 用于在所述双链DNA分子远离H(G) "单元的一端连接接头；以及扩增单元，所述扩增单元与 所述接头连接单元相连，并且用于对所述接头连接单元的连接产物进行扩增，以便获得扩 增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。 利用根据本专利技术实施例的用于基于单链DNA构建测序文库的装置，能够利用微量 单链DNA样品进行测序文库的构建，并且保留了单链DNA链的特异性，样品损失少，基因信 息保持完整，且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA文库的构建。 根据本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一种确定单链DNA分子的序列信息的方 法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：基于所述单链DNA分子，根据前述方法构建测序文 库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述单链 DNA分子的序列信息。利用根据本专利技术实施例的确定单链DNA分子的序列信息的方法，能够灵敏、准确、 高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，并且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA 分子，从而实现对样品的全基因组或特定区域基因组的甲基化检测。 根据本专利技术的又一方面，本专利技术提供了一种确定单链DNA序列信息的系统。根据 本专利技术实施例，该系统其包括：测序文库构建装置，采用前述方法制备样本基因的测序文 库；测序装置，所述测序装置与所述测序文库制备单元相连，以便用于对所述样本的基因测 序文库进行测序，获得所述样本DNA的测序结果；以及分析装置，对所述样本DNA的测序结 果进行分析，以便获得所述单链DNA序列信息。 采用根据本专利技术实施例的确定单链DNA分子的序列信息的系统，能够灵敏、准确、 高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，并且可以应用该系统对全基因组甲基化 DNA分子的序列进行分析，从而实现对样品的全基因组或特定区域基因组的甲基化检测。 根据本专利技术的再一方面，本专利技术提供了一种确定RNA样本的序列信息的方法。根 据本专利技术实施例，该方法包括：对RNA样本进行反转录，以便获得单链DNA分子；基于所述 单链DNA分子，通过根据前述的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于 所述测序结果，确定所述RNA样本的序列信息。 利用根据本专利技术实施例的确定RNA样本的序列信息的方法，能够灵敏、准确、高效 地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，从而实现对样本的基因组的检测。 根据本专利技术的一个方面，本专利技术提供了一种用于确定染色质目标区域的序列信 息的方法。根据本专利技术实施例，该方法包括：将染色质进行随机打断，以便获得长度为 200bp~500bp的染色质样本；利用抗体对所述染色质样本进行染色质免疫共沉淀，所述抗 体特异性识别所述目标区域，以便获得包含所述目标区域的双链DNA样本；对所述包含所 述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；基于所述单链DNA分 子，通过根据前述的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于所述测序结 果，确定所述染色质目标区域本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于单链DNA分子构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，n代表碱基C的数目，并且n为5～30之间的整数；(2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5～15之间的整数；以及(3)在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，可选地，所述单链DNA分子是通过对RNA进行逆转录而获得的，可选地，所述单链DNA分子是通过对RNA进行逆转录而获得的cDNA分子，可选地，所述单链DNA分子是通过对双链DNA样本进行变性而获得的，可选地，所述单链DNA分子是通过对双链DNA样本进行热变性而获得的，可选地，所述双链DNA样本是通过染色质免疫共沉淀而获得的，可选地，所述双链DNA样本是通过对DNA样本进行随机打断而获得的，可选地，在所述随机打断之后，利用探针对所述随机打断的产物进行筛选，任选地，所述随机打断是通过超声处理进行的，可选地，在所述随机打断之后，对所述随机打断的产物进行末端修复处理，可选地，所述单链DNA分子的量为≥25pg，任选地，所述单链DNA分子的量为25pg～1000pg，可选地，所述单链DNA分子的长度为200～500nt，可选地，n为15～25之间的整数，优选地n为20，可选地，所述poly(C)n尾部是利用末端转移酶形成的，可选地，在步骤(2)中，利用KAPA2G Robust HS获得所述双链DNA分子，可选地，m为9，可选地，所述延伸引物由SEQ ID NO：1所示的核苷酸构成，可选地，所述延伸引物具有筛选标记，其中，所述筛选标记形成于所述延伸引物的5’末端，可选地，所述筛选标记为生物素，可选地，在步骤(3)中，在所述双链DNA分子连接接头之后，进行扩增之前，对所述连接有接头的双链DNA分子进行纯化，其中，所述纯化是利用特异性识别生物素的珠子进行的，可选地，所述珠子为磁珠，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素，可选的，通过超纯蒸馏水72摄氏度加热对所述纯化产物进行洗脱，以便获得纯化的接有接头的双链DNA分子。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：颉伟，尹强宗，吴婧怡，徐丰，彭旭，
申请(专利权)人：清华大学，新加坡科技研究局临床科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11