一种发酵生产4-Acetylantroquinonol B的方法技术

本发明专利技术属于发酵技术领域，特别涉及一种发酵产4-Acetylantroquinonol B的方法。牛樟芝是一种专性寄生于台湾腐朽牛樟树上的真菌，其子实体中含有多种天然活性物质，其中4-Acetylantroquinonol B是近几年从其子实体中分离出的一种具有较好的抗癌作用的物质，但目前牛樟芝的研究主要集中在提高菌体量、多糖产量方面，对樟芝特有的活性代谢产物4-Acetylantroquinonol B为目标的发酵研究较少，本发明专利技术从牛樟芝菌种出发，通过分阶段发酵培养、培养条件和培养基组成的优化，最终在不添加任何诱导物和前提物的情况下，从牛樟芝液体发酵所获得的菌体中获得4-Acetylantroquinonol B，其产量达2.6-5mg/g。该方法是一种发酵生产4-Acetylantroquinonol B的新方法。

【技术实现步骤摘要】
一种发酵生产4-AcetylantroquinonolB的方法
本专利技术属于生物发酵
，特别涉及一种发酵生产4-乙酰基安卓奎诺尔B(4-AcetylantroquinonolB)的方法。
技术介绍
牛樟芝子实体寄生于牛樟树树干腐朽的内壁或倒伏在地上靠近土表的无树皮表面，具有强烈的牛樟树香气，含有高含量精油，外形呈板形、钟形、马蹄形或是不规则形状，多年生、无柄，紧贴于木材表面生长。不少学者对牛樟芝子实体活性成分及其药理活性进行了研究，证实牛樟芝子实体含有高氧化度三萜、活性多糖、甾醇等多种活性成分等。近年来，牛樟芝子实体中又分离鉴定出的了4-AcetylantroquinonolB等三萜类化合物，其在保肝、抗癌方面具有卓越的疗效。Yu-WeiLin等已研究证实4-AcetylantroquinonolB在治疗肝癌上有较好的效果；Tung-ChengChang等也已研究证实4-AcetylantroquinonolB在治疗大肠癌上同样具有较好的效果，其不仅能够抑制癌细胞的增长，也能够有效的降至癌细胞的抗药性，是一种具有应用前景的癌症治疗药物。但是，由于牛樟芝严格的寄主特性以及自然产量的稀少，而且其唯一寄主牛樟树资源也十分匮乏，致使牛樟芝子实体远不足供应市场需求且价格十分昂贵。而利用现代生物技术进行樟芝人工培养得到菌体产物是解决樟芝供需矛盾的有效解决方式，Yu-WeiLin等已经从液体培养的牛樟芝菌体中鉴定出了4-AcetylantroquinonolB，但是其产量低；Chien-ChiChiang等采用液体发酵的方式，通过加入诱导物有效的提高了液态发酵的菌体中4-AcetylantroquinonolB的含量，最终其产量达0.8mg/g；因此通过液体发酵法来获得4-AcetylantroquinonolB的研究仍处于初级阶段，而不添加任何诱导物或前提物的条件下液态发酵产4-AcetylantroquinonolB的研究尚未见报导。本专利技术从实验室自主分离出的牛樟芝菌种出发，在不添加任何诱导物和前提物的情况下，分两阶段发酵培养，从牛樟芝液体发酵的菌体中获得了较高产量的4-AcetylantroquinonolB。
技术实现思路
本专利技术目的是克服现有技术产量低的不足，提供一种利用牛樟芝菌丝体发酵获得高产量活性物质4-乙酰基安卓奎诺尔B(4-AcetylantroquinonolB)的新方法。本专利技术为实现上述目的采取以下技术方案，一种发酵生产4-AcetylantroquinonolB的方法，包括如下步骤：(1)菌种的扩大培养：以挖块接种将牛樟芝菌接种至新的固体培养基中进行菌种的扩大培养，待固体培养基中形成新的牛樟芝菌落；(2)牛樟芝孢子悬液的制备：在新的固体培养牛樟芝菌落中加入无菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子悬液；(3)牛樟芝菌液体种子培养：将制备好的孢子悬液加入液体种子培养基中培养，通过优化培养条件和培养基组成，使液体种子形成规则的小球状；(4)第一阶段液体发酵：将步骤(3)的液体种子接种至液体发酵培养基中，100-180rpm，20-26℃，培养8-12d；(5)第二阶段液体发酵：第一阶段发酵培养后，补加葡萄糖，调整发酵条件为180-220rpm，27-35℃，培养5-10d；(6)菌体干重的测定：发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重；(7)菌体胞内物质提取：取烘干后的菌体，采用常规方法进行破胞处理并提取目标活性物质4-AcetylantroquinonolB。进一步地，所述步骤(1)中固体培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨2-5g/L，麦芽浸粉10-30g/L，琼脂20-35g/L。进一步地，所述步骤(2)孢子悬液中孢子数含量为106-107个/mL。进一步地，所述步骤(3)中液体种子培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO40.5-2g/L，MgS04·7H2O0.05-0.2g/L，116℃灭菌25min。进一步地，所述步骤(4)中液体发酵培养基组成为:葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HPO40.5-1.5g/L，MgS04·7H2O0.1-0.8g/L，麦芽浸粉15-25g/L，苯酚0.05-0.2g/L。进一步地，所述步骤(4)中液体种子的接种量为10％-30％。进一步地，所述步骤(5)中补加葡萄糖的质量按照每1L初始液体发酵培养基补加葡萄糖10-50g。进一步地，利用高效液相色谱对所述步骤(7)提取得到的目标活性物质4-AcetylantroquinonolB进行测定。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点和有益效果：(1)与其他培养方法相比，本专利技术所使用的方法在发酵过程中不添加任何诱导物或前提物的条件下获得了活性物质4-AcetylantroquinonolB。(2)本专利技术所使用的两阶段发酵培养方法从牛樟芝菌丝体中获得较高产量的活性物质4-AcetylantroquinonolB，产量最高可达5mg/g。具体实施方式下面结合具体实例进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。下述实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。本专利技术实施方式中所述牛樟芝或牛樟芝菌，优选现有技术中一株Antrodiacamphorata(同义名:Taiwanofunguscamphorates；Ganodermacamphoratum；Antrodiacinnamomea)YMT1002菌株，该菌株子实体保藏于台湾生物资源保存及研究中心(简称BCRC)(BCRCNumber：35396)，可通过购买方式获得。本专利技术方法也可采用现有技术中其他牛樟芝菌株。实施例1以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体种子培养的操作工艺如下：1)牛樟芝孢子的制备：利用挖块接种法，将牛樟芝菌接种至新的固体培养基中，固体培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨2.5g/L，麦芽浸粉20g/L，琼脂25g/L，避光培养20-25天后，新的圆形菌落形成，直径约4-5cm，菌落中心呈橙色，边缘呈白色，保存于4℃备用。2)牛樟芝孢子悬液的制备：经扩大培养后的新菌落可用于制备孢子悬液。4℃保存的菌种于室温中放置1-2h后，无菌条件下加入10-15mL无菌水，用玻璃棒轻轻刮下菌落表面的孢子，最终菌悬液呈浑浊的橙色，其中孢子数为106-107个/mL。3)牛樟芝液体种子的制备：装液量为100mL/250mL，培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，KH2PO41.5g/L，MgS04·7H2O0.1g/L，116℃灭菌25min。加入1-2mL制备好的孢子悬液，置于110rpm，25℃的恒温摇床中培养3-4天，菌体呈规则球状，直径约为1-2mm，可接种至发酵培养基中。实施例2以装液量250mL的三角瓶发酵为例，牛樟芝液体发酵培养产4-AcetylantroquinonolB的操作工本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵生产4‑Acetylantroquinonol B的方法，其特征在于，包括如下步骤:(1)菌种的扩大培养：以挖块接种将牛樟芝菌接种至新的固体培养基中进行菌种的扩大培养，待固体培养基中形成新的牛樟芝菌落；(2)牛樟芝孢子悬液的制备：在新的固体培养牛樟芝菌落中加入无菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子悬液；(3)牛樟芝菌液体种子培养：将制备好的孢子悬液加入液体种子培养基中培养，通过优化培养条件和培养基组成，使液体种子形成规则的小球状；(4)第一阶段液体发酵：将步骤(3)的液体种子接种至液体发酵培养基中，100‑180rpm，20‑26℃，培养8‑12d；(5)第二阶段液体发酵：第一阶段发酵培养后，补加葡萄糖，调整发酵条件为180‑220rpm，27‑35℃，培养5‑10d；(6)菌体干重的测定：发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2‑3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重；(7)菌体胞内物质提取：取烘干后的菌体，采用常规方法进行破胞处理并提取目标活性物质4‑Acetylantroquinonol B。

【技术特征摘要】
1.一种发酵生产4-AcetylantroquinonolB的方法，其特征在于，包括如下步骤:（1）菌种的扩大培养：以挖块接种将牛樟芝菌（Antrodiacamphorata）接种至新的固体培养基中进行菌种的扩大培养，待固体培养基中形成新的牛樟芝菌落；所述牛樟芝菌为AntrodiacamphorataBCRC35396菌株；（2）牛樟芝孢子悬液的制备：在新的固体培养牛樟芝菌落中加入无菌水，以玻璃棒刮下孢子，形成孢子悬液；（3）牛樟芝菌液体种子培养：将制备好的孢子悬液加入液体种子培养基中培养，通过优化培养条件和培养基组成，使液体种子形成规则的小球状；（4）第一阶段液体发酵：将步骤（3）的液体种子接种至液体发酵培养基中，100-180rpm，20-26℃，培养8-12d；液体发酵培养基组成为:葡萄糖15-25g/L，蛋白胨5-10g/L，K2HPO40.5-1.5g/L，MgS04·7H2O0.1-0.8g/L，麦芽浸粉15-25g/L，苯酚0.05-0.2g/L；（5）第二阶段液体发酵：第一阶段发酵培养后，补加葡萄糖，调整发酵条件为180-220rpm，27-35℃，培养5-10d；补加葡萄糖的质量按照每1L初始液体发酵培养基补加葡萄糖10-50g；（6）菌体干重的测定：发酵结束后取出菌体，抽滤，除去菌体中的液体培养基，再以去离子水冲洗2-3次，抽滤，烘干至恒重，测定其质量即为菌体干重；（7）菌体胞内物质提取：取烘干后的菌体，采用常规方法进行破胞处理并提取目标活性物质4-AcetylantroquinonolB。2.如权利要求1所述的一种发酵生产4-AcetylantroquinonolB的方法，其特征在于，所述步骤（1）中固体培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨2-5g/L，麦芽浸粉10-30g/L，琼脂20-35g/L。3.如权利要求1所述的一种发酵生产4-AcetylantroquinonolB的方法，其特征在于，所述步骤（2）孢子悬液中含有孢子数为106-107个/mL。4.如权利要求1所述的一种发酵生产4-AcetylantroquinonolB的方法，其特征在于，所述步骤（3）中液体种子培养基组成为：葡萄糖10-30g/L，蛋白胨5-15g/L，KH2PO40.5-2g/L，MgS04·7H2O0.05-0.2g/L，116℃灭菌25mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓利，刘欢，王萌，曾耀铭，
申请(专利权)人：厦门北化生物产业研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35