本发明专利技术提供鸭支原体培养基，由液体培养基和固体培养基组成，液体培养基由以下组分组成：去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；除添加琼脂粉，去掉酚红外，固体培养基其余组分与液体培养基相同。利用上述培养基对鸭支原体分离纯化：在固体培养基上分离菌落，将分离的菌落置于液体培养基中生长，然后进行液体培养物的过滤、稀释、涂板和挑单菌落增殖的纯化步骤，重复上述步骤直至得到纯化的鸭支原体。本发明专利技术的培养基可促进鸭支原体的生长，且分离纯化鸭支原体的成功率高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细菌培养基及分离纯化的方法，具体涉及。
技术介绍
鸭支原体(Mycoplasmaanatis)主要引起鸭的传染性窦炎，临床上易感染雏鸭，导致眶下窦、鼻腔、气管及气囊的炎症，其中眶下窦肿胀最为典型。当鸭支原体与其他病原(如流感病毒、大肠细菌)混合感染时，可引起鸭呼吸困难、软脚、腹泻、共济失调、斜颈、转圈或倒退运动等一系列神经系统症状，严重影响鸭的生长和发育；组织学病变表现为淋巴细胞性脑膜炎、纤维蛋白渗出性的气囊炎、间质性肺炎和淋巴滤泡性气管炎(Stipkovits，2012)o1964年Robert首次报道从患有窦炎的小鸭中分离出鸭支原体，之后西班牙、美国等国家相继分离到鸭支原体，karpas、Amin等从北京鸭、短颈小野鸭和斑背浅鸭中分离出鸭支原体(Ivanics et al，1988;Poveda et al，1990;Goldberg et al，1995)。我国是世界上主要的鸭养殖基地，鸭肉产量占全球总量的66%;国内学者于1989年和1991年就证实了鸭支原体在我国的存在，而近两年国内有关鸭支原体合并病毒、细菌感染的病例屡见不鲜，给养鸭业造成了重大危害和经济损失，表明鸭支原体感染在我国持续时间已经很久。鸭支原体是一类特殊的微生物，无细胞壁，由于其基因组较小，造成基因组中编码氨基酸和辅助因子合成的基因就少，导致支原体生物合成和代谢的能力相当有限；由于支原体属于氨基酸、脂类和某些辅助因子营养缺陷型，很难对环境变化做出调整，仅在特定的环境下生存，因此鸭支原体对体外培养基的选择相当苛刻，需要从中摄取脂肪酸、胆固醇、核酸前体和能量来源等营养成分促进自身繁殖。鸭支原体(Mycoplasma anatis)不同于其他禽类支原体，如鸡毒支原体(Mycoplasma gal lispeticum)、滑液支原体(Mycoplasmasymoviae)、泄殖腔支原体(Mycoplasma cloaclae)、莱氏无胆甾支原体(Acolaplasmalaidlawii)等感染多种宿主，鸭支原体只寄生于鸭体内。关于鸭支原体的诊断，主要为聚合酶链反应(PCR)和直接免疫荧光实验(FA)，二者均涉及支原体纯培养物即单个菌落的分离和培养;而目前分离鸭支原体使用的人工培养基一般均由Frey或PPL0培养基改良而来，仍存在活菌滴度低、繁殖能力差等问题，易产生漏诊；因此，本领域亟需高效稳定、快速分离诊断鸭支原体的培养基以及分离纯化鸭支原体的方法，进而开展鸭支原体感染的治疗与防控研究。
技术实现思路
本专利技术提供了鸭支原体培养基，该培养基能够用来分离纯化鸭支原体，活菌滴度高，繁殖能力强;本专利技术还提供应用该培养基分离纯化鸭支原体的方法。本专利技术为解决以上技术问题所采用的方案为:鸭支原体培养基，包括液体培养基和固体培养基，所述液体培养基由以下组分组成:去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸； 所述固体培养基由以下组分组成:去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，琼脂粉，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L-半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。作为优选，所述液体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L，PPLO肉汤3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8_10g/L，1%的酚红2_3mL/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500mL/L，灭活的马血清150-180mL/L，酵母浸出液45-55mL/L，青霉素200-300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L，余量为去尚子水。最优选地，所述液体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPL0肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，1%的酚红2mL/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。作为优选，所述固体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.5-6mL/L，PPLO肉汤3-5g/L，葡萄糖4-6g/L，蛋白胨4-6g/L，胰蛋白胨8_10g/L，琼脂粉10_12g/L，含L-谷氨酰胺的CMRL-1066培养基450-500 mL/L，灭活的马血清150_180mL/L，酵母浸出液45_55mL/L，青霉素200-300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.1-0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.1-0.2g/L，余量为去呙子水。最优选地，所述固体培养基由以下组分组成:10%的醋酸铊溶液4.8mL/L，PPLO肉汤3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨4.8g/L，胰蛋白胨10g/L，琼脂粉12g/L，含L-谷氨酸的CMRL-1066培养基450mL/L，灭活的马血清180mL/L，酵母浸出液45mL/L，青霉素300万单位/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.2g/L，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.2g/L，余量为去离子水。作为优选，所述酵母浸出液的制备方法为:将酵母溶于5倍去离子水中，在30°C下磁力搅拌1小时；10-15分钟内逐渐增加温度到40°C ；之后每分钟增加5°C至沸点，煮沸3-5分钟，冷却至室温，离心，取上清，依次经0.8 μηι、0.45 μηι、0.22 μπι的滤器过滤后收集滤液即得。采用上述方法制备得到的酵母浸出液具备以下优点:不断搅拌可使酵母的溶解性增加，浸出液色泽为淡黄色至黄色;缓慢升高温度可减少浸出液营养成份的破坏;整个制备过程的总时间控制在2小时左右，减少了污染杂菌的概率。作为优选，除添加琼脂粉，去掉酚红指示剂外，所述固体培养基其余组分和各组分含量均与液体培养基相同。通常情况之下，固体培养基与液体培养基成分应该保持一致的，这样能够确保支原体生长状态的稳定；另外在大批量配置液体及固体培养基时可同时进行，节省人力和时间。本专利技术还提供上述培养基的制备方法，所述液体培养基的制备方法为:将配方量的去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPL0肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红充分混匀，调pH值为7.8，121°C高压灭菌15分钟，冷却至50-55°C，加入配方量的无菌的CMRL-1066培养基(含L-谷氨酰胺)，灭活的马血清，酵母浸出液，无菌的青霉素水溶液，无菌的L-半胱氨酸盐酸盐水溶液以及无菌的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水溶液，添加时无先后顺序，最后微调pH值至 7.7-7.8。作为优选，所述固体培养基的制备方法为:将配方量的去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPL0肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，琼脂粉充分混匀，调pH值为7.8,121°C高压灭菌15分钟，放入50-55°C的水浴锅中冷却，加入配方量的无菌的CMRL-1066培养基(含L-谷氨酰胺)，灭活的马血清，酵母浸出液，无菌的青霉素水溶液，无菌本文档来自技高网...
【技术保护点】
鸭支原体培养基，其特征在于：由液体培养基和固体培养基组成，所述液体培养基由以下组分组成：去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，1%的酚红，含L‑谷氨酰胺的CMRL‑1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L‑半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；所述固体培养基由以下组分组成：去离子水，10%的醋酸铊溶液，PPLO肉汤，葡萄糖，蛋白胨，胰蛋白胨，琼脂粉，含L‑谷氨酰胺的CMRL‑1066培养基，灭活的马血清，酵母浸出液，青霉素，L‑半胱氨酸盐酸盐和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：宫晓炜，刘永生，陈启伟，郑福英，储岳峰，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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