一种用于DNA分子多位点突变的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于环状DNA分子多位点突变的方法。本发明专利技术提供了一种用于环状DNA分子多位点突变的方法，包括如下步骤：1)针对环状DNA分子编码氨基酸中p个待突变氨基酸位点密码子设计q个引物对；2)以所述环状DNA分子为模板，用引物对进行片段扩增；3)将全部片段加入不含有引物的overlap PCR反应体系中反应，待反应至第7-8个循环时，再向所述反应体系中加入引物对中的任一个，继续反应，实现环状DNA分子多位点突变。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术通过使用兼并性密码子设计的引物以及改良的POE-PCR方法来对质粒进行多位点突变，完成突变体库的构建，步骤简单、突变效率高、产生序列错乱的情况少、对酶的依赖度低，因此可以大大降低实验成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种用于DNA分子多位点突变的方法。
技术介绍
在蛋白工程领域，定向进化技术是一种可以加速目的蛋白进化成带有特定性状蛋 白的有力工具。在蛋白定向进化的整个流程中，蛋白突变体库的构建是很重要的一环，突 变体库的大小、偏好性直接关系着定向进化技术的效率和得到目的蛋白的可能性。突变体 库构建最常规的办法是通过error-prone PCR或者DNA shuffling来完成，然后将此突变 体库插入到蛋白表达载体上，再转化进感受态细胞中进行表达。虽然error-prone PCR和 DNA shuffling本身可以生成一个非常大的突变体库（长度为lkb，总量为lug的DNA双链 约含1012个DNA分子），但是通常在经过亚克隆（突变体库插入蛋白表达载体）这一步后， 突变效率会大为降低（通常只能得到1〇 3-1〇6个突变体），这种低效率产生的原因包括：载 体和插入片段酶切的效率低、连接效率低以及载体自连现象。除此之外，亚克隆这一步通常 需要两个限制性内切酶，而每个限制性内切酶在突变体片段及载体上都只能有一个酶切位 点，因此这大大限制了可用的限制性内切酶的种类。 针对这些局限性，Maynard等人提出了一种不需要限制性内切酶来进行突变体 库构建的方法，他们使用很多大引物、T7聚合酶、T4DNA连接酶以及一个特殊的感受态细 胞dut +ung+E. coli来完成，但是因为dut+ung+菌株很难获得，并且此技术的实验方法比 较繁琐，因此并不是一个很好的方法。另一个用于突变体库构建的方法是全质粒的大引 物PCR(MegaWHOP)，是QuikChange单位点突变的衍生方法。但是，这种方法需要大量的 (l-2ng/ul)来源于dam +菌株中的质粒做模板，并且需要大量的dpnl酶来完全消化模板。 除此之外，MegaWHOP方法的转化效率约为10 4-105个突变体/lug DNA，转化效率也不是很理 想。 在此情况下，Zhang等人研发出了一种基于PCR技术的不需要限制性内切酶以及 连接酶的突变体库构建方法。这种方法主要包括三步：一，通过高保真性PCR反应来合成 需要的DNA片段；二，通过prolonged overlap extension PCR来合成DNA多聚体；三，将 DNA多聚体转化进感受态细胞中。这种方法的问题在于转化大肠杆菌的效率比较低。而之 后为了提高这种方法在大肠杆菌宿主细胞的转化效率并且使这个方法更加适用于突变体 库的构建，他们在合成DNA多聚体后用限制性内切酶进行酶切并且用T4DNA聚合酶进行连 接。但是，这样依然无法摆脱对于酶的依赖，而且这种方法获得的突变体库有部分出现序列 混乱的情况。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于DNA分子多位点突变的方法。 本专利技术提供了用于DNA分子多位点突变的方法，包括如下步骤： 1)针对DNA分子中p个待突变位点设计合成q个引物对，q小于等于p ;p和q均 为大于等于1的整数；根据所述P个待突变位点在所述DNA分子的位置，顺次将q个引物对 分别编号为Ι-q ; 每个所述引物对由互为反向互补序列的上游引物和下游引物组成，其中所述上游 引物包含突变位点对应的突变后核苷酸；所述引物对中每条引物的大小均为30_40nt ; 2)将q个所述引物对中的每个引物对的上游或下游引物与其相邻的引物对的下 游或上游引物作为组合引物对，分别对所述DNA分子进行PCR扩增，得到不同的扩增片段； 所述每个组合引物对对应的扩增片段与其相邻的组合引物对对应的扩增片段均具有互补 配对区域； 3)将所有的所述扩增片段进行overlap PCR反应，获得突变的DNA分子。 上述上游引物包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于二者之间一个或多个突变位点 对应的核苷酸，所述DNA片段甲和所述DNA片段乙的大小均大于或等于10bp。 上述方法中，所述DNA分子为环状的DNA分子。 上述方法中， 步骤2)包括如下步骤：用引物对1的上游引物1和引物对2的下游引物2,进行 PCR扩增，得到片段1，用所述引物对2的上游引物2和引物对3的下游引物3,进行PCR扩 增，得到片段2,依次推导，用引物对q-Ι的上游引物q-Ι和引物对q的下游引物q进行PCR 扩增，得到片段q_l，用所述引物对q的上游引物q和所述引物对1的下游引物1进行PCR 扩增，得到片段q。 上述方法中， 步骤3)包括如下步骤：将步骤2)中所述片段1至所述片段q的全部片段加入不 含有引物的over 1 ap PCR反应体系中反应，再向加入q个所述引物对中的任一个，继续反 应，得到含有突变位点的环状DNA分子，实现环状DNA分子多位点突变。 上述方法中， 所述DNA分子为线状DNA分子。 上述方法中， 步骤1)还包括：设计引物X0和引物XP的步骤； 所述引物X0的靶序列位于引物对1靶序列的上游，且所述引物X0与引物对1上 游引物的延伸方向一致；； 所述引物XP的靶序列位于引物对q靶序列的下游，且所述引物XP的延伸方向与 所述引物对q下游引物的延伸方向一致； 步骤2)包括如下步骤：用所述引物对1的上游引物1和引物对2的下游引物2,进 行PCR扩增，得到片段1，用所述引物对2的上游引物2和引物对3的下游引物3,进行PCR 扩增，得到片段2,依次推导，用引物对q-Ι的上游引物q-Ι和引物对q的下游引物q进行 PCR扩增，得到片段q_l，用所述引物对q的上游引物q和所述引物Xp进行PCR扩增，得到 片段q，用所述引物X0与所述引物对1的下游引物1进行PCR扩增，得到片段q+Ι ; 步骤3)包括如下步骤：将所述片段1至所述片段q+1的全部片段加入不含有引物 的overlap PCR反应体系中反应，再加入所述引物X0和所述引物Xp，继续反应，得到含有突 变位点的线状DNA分子，实现线状DNA分子多位点突变。 上述方法中， 步骤2)包括如下步骤：用引物对1的上游引物1和引物对2的下游引物2,进行 PCR扩增，得到片段1，用引物对2的上游引物2和引物对3的下游引物3,进行PCR扩增， 得到片段2,依次推导，用引物对q-Ι的上游引物q-Ι和引物对q的下游引物q进行PCR扩 增，得到片段q _l ; 步骤3)包括如下步骤：将所述片段1至所述片段q-Ι的全部片段加入不含有引物 的overlap PCR反应体系中反应，再加入所述引物对q的下游引物q和所述引物对1的上 游引物1进行PCR扩增，继续反应，得到含有突变位点的环状DNA分子，实现线状DNA分子 多位点突变。 上述方法中， 步骤3)中，所述再加入引物的时间为待所述反应至第7-8个循环时。 上述方法中， 所述待突变位点为所述DNA分子编码的氨基酸对应的密码子或所述DNA分子的核 苷酸。 上述方法中， 所述的氨基酸密码子为兼并密码子或者非简并密码子。 上述方法中， 所述DNA分子为环状DNA分子； 所述p个待突变位点为3个待突变核苷酸位点，且所述q个引物对为2个引物对； 或所述p个待突变位点为12个待突变核苷酸位点，且所述q个引物对为3个引物 对； 所述3个待突变核苷酸位点为所述环状DNA分子核苷酸序列第2184位C、第4673 位的G和第4674位的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于DNA分子多位点突变的方法，包括如下步骤：1)针对DNA分子中p个待突变位点设计合成q个引物对，q小于等于p；p和q均为大于等于1的整数；根据所述p个待突变位点在所述DNA分子的位置，顺次将q个引物对分别编号为1‑q；每个所述引物对由互为反向互补序列的上游引物和下游引物组成，其中所述上游引物包含突变位点对应的突变后核苷酸；所述引物对中每条引物的大小均为30‑40nt；2)将q个所述引物对中的每个引物对的上游或下游引物与其相邻的引物对的下游或上游引物作为组合引物对，分别对所述DNA分子进行PCR扩增，得到不同的扩增片段；所述每个组合引物对对应的扩增片段与其相邻的组合引物对对应的扩增片段均具有互补配对区域；3)将所有的所述扩增片段进行overlap PCR反应，获得突变的DNA分子。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：郑越，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44