本发明专利技术提供了一种环二肽类化合物的制备方法，所述方法是将桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101接种在含钴离子的发酵培养基中，在25～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养5～7d后，再在25～30℃下静置4～5d，将培养液分离纯化，获得环(甘-脯)二肽、环(丙-脯)二肽、环(异亮-脯)二肽和环(丙-缬)二肽化合物；本发明专利技术所述培养方法使桔青霉MNP12010101细胞合成了常规培养条件下不能合成的环二肽；培养基组成简单，工艺简单，发酵成本低；桔青霉MNP12010101细胞合成的4种环二肽具有抗肿瘤活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及利用一株海洋真菌--半知菌纲壳霉目杯霉科青霉属桔青霉 (Penicillium citrinum)MNPl2010101 制备环二肽的方法。 (二)
技术介绍
海洋天然产物已成为药物先导化合物的重要来源之一。从20世纪60年代起，寻找 海洋来源的天然活性物质已成为一大研究热点。最初的研究，人们主要集中在一些海洋低 等生物，如软体动物，藻类、浮游生物等。随着研究的深入，越来越多结构奇特并具良好活性 的天然产物相继被分离。1988年~1992年间，海洋微生物产生的新化合物几乎从零升到 12.7%，而来源于陆栖真菌产生的新化合物已由74.7%下降到50.5%。 常规方法培养海洋微生物，分离和筛选活性次生代谢产物，难度越来越大。如果利 用环境胁迫、调节生物合成途径以及利用基因调控等手段，阻断途径特异性抑制子或激活 相关的"沉默"基因，激活隐性次生代谢产物生物合成，挖掘海洋微生物合成次代谢产物的 能力，从新合成的代谢中筛选具有生物活性物质，则有望筛选到新型生物活性物质或先导 化合物。 在前期研究中，从海水中分离到一株桔青霉MNP12010101菌株（中国专利技术专利 ZL201210572388.3)能够产生抑制神经癌细胞(PC12)，肝癌细胞(HepG2)和组织细胞淋巴瘤 细胞(U937)的活性物质。是一个表现"突出"的海洋真菌，但从霉菌合成次生代谢产物多样 性角度看，合成活性次生代谢产物的能力还没有完全"发挥"。如采用环境胁迫激活桔青霉 "沉默"基因的表达，产生更多的次生代谢产物，就有可能筛选到更多或活性更好的次生代 谢产物。本专利技术采用高浓度的钴离子胁迫培养桔青霉MNP 12010101菌株，从代谢产物中获 得具有生物活性的化合物。 环二肽（cyclic dipeptides)，又名2，5_二氧哌嗪（2,5-dioxopiperazines)或2， 5-二酮哌嗪(2,5-(111^1：(^1口6瓜2；[1168)，由两个氨基酸通过肽键环合形成，是自然界中最小 的环肽。环二肽在人、脊椎动物、无脊椎动物、植物、真菌和细菌中均有发现，由于它们的结 构中有一个稳定的六元环结构，具有一定的构象约束作用，有2个氢键给体和2个氢键受体， 氢键是药物与受体相互作用的主要方式之一，因而环二肽在药物化学中是一个重要的药效 团，目前发现许多环二肽具有较好的生理活性，如影响胞间信息传递、抑菌、抑制毒素活性、 促癌细胞凋亡、镇痛以及免疫增强等。近些年来引起了有机化学、生物学和药物学研究领域 的广泛兴趣。作为肽类化合物中最具有特点的一类化合物，其生物活性方面具有巨大的发 掘和开发潜力。 (三)
技术实现思路
本专利技术涉及利用一株海洋真菌一半知菌纲壳霉目杯霉科青霉属桔青霉 (Penicillium citrinum)MNP12010101制备环二肽类化合物（即环(甘-脯）二肽、环（丙-脯） 二肽、环(异亮-脯)二肽和环(丙-缬)二肽）的方法。采用常规的培养基培养，未发现该菌株 产生环二肽，但在培养基中添加高浓度的钴离子(是常规微生物培养基的200~1000倍），创 造了一种重金属离子胁迫环境，菌体代谢途径受到影响，虽然细胞生长量有所下降，但发酵 总浸膏的抗肿瘤活性则相对提高，从总浸膏中分离得到上述4种环二肽类化合物。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供，所述方法是将桔青霉(Peni ci 11 ium citrinum)MNP12010101接种在含钴离子的发酵培养基中，在25~30°C、200~250r/min恒温 振荡条件下培养5~7d后（即培养至菌体干重达到10~12g/L)，再于25~30°C下静置4~5d， 将培养液分离纯化，获得环二肽类化合物（即环(甘-脯)二肽、环(丙-脯)二肽、环(异亮-脯） 二肽和环(丙-缬)二肽）；所述发酵培养基组成为:葡萄糖10~20g/L，蛋白胨2~5g/L，酵母 浸膏1~2g/L，溶剂为体积比1:1~2的人工海水与蒸馏水混合液，pH 6~7,高压蒸汽121°C 灭菌 15~20min;所述每升人工海水组成为：NaC124.48g，Na2S〇4 3.917g，KCl 0.664g，KBr 0.096g,SrCl2 0.024g,MgCl · 6H2O 4.981g,CaCl2 · H20 1.102g,NaHC03 0.192g,H3B03 0.026g，NaF 0.004g，用蒸馏水定容至1L。进一步，所述钴离子以氯化钴的形式加入，所述氯化钴在发酵培养基中的终浓度 为1~2g/L，优选lg/L，是常规微生物培养基的200~1000倍。进一步，优选所述的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸膏2g/ L，溶剂为体积比1:1.5的人工海水与蒸馏水混合液，pH 7.0。 本专利技术所述桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101在发酵培养前先进行斜 面培养和种子培养： (1)斜面培养：将桔青霉MNP12010101接种于斜面培养基，于25~30°C培养48~ 60h，获得斜面菌种孢子;所述的斜面培养基组成为：马铃薯150~250g/L(煮沸30min后过滤 去渣），葡萄糖15~30g/L，琼脂18~20g/L，溶剂为人工海水，pH自然，高压蒸汽121°C灭菌15 ~20min;所述人工海水组成同发酵培养基； (2)种子培养：将桔青霉MNP12010101的活化培养的菌种孢子接种于种子培养基 中，于25~30°C、150~250r/min振荡条件下培养36~48h，得种子液;所述的种子培养基组 成为:葡萄糖10~20g/L，蛋白胨2~5g/L，酵母浸膏1~2g/L，溶剂为体积比1:1~2的人工海 水与蒸馏水混合液，pH 6~7,高压蒸汽121°C灭菌15~20min;所述人工海水组成同发酵培 养基。 本专利技术将桔青霉MNP12010101经过活化培养、种子培养和发酵培养，得到含环二肽 的培养物，培养物经过提取分离纯化，可获得4种环二肽类化合物，即环（甘-脯）二肽、环 (丙-脯)二肽、环(异亮-脯)二肽和环(丙-缬)二肽，具体本专利技术所述从培养液分离纯化获得 环二肽类化合物的方法为： (1)将培养液过滤，滤液用同体积的乙酸乙酯萃取3~5遍，合并萃取液，于45°C减 压蒸馏除去乙酸乙酯，所得膏状物即为发酵液提取物;滤饼用等同过滤前培养液体积的甲 醇浸泡12~24h，再于25°C、100KHz超声提取30~60min，二次过滤除去菌体，二次滤液于50 °C减压蒸馏除去甲醇和水分，所得二次膏状物用甲醇溶解，离心弃去沉淀，上清液再次于50 °C减压蒸馏除去甲醇，反复1~3次，获得菌体提取物，合并发酵液提取物和菌体提取物，BP 为发酵总浸膏； (2)将步骤（1)制备的发酵总浸膏用少量甲醇溶解后采用AB-8大孔吸附树脂进行 分离，先用2倍柱体积的纯水淋洗，洗脱液弃去，再分别用2倍柱体积的体积浓度为20%、 40%、60%的乙醇水溶液洗脱，分别收集流出液Π、流出液f2和流出液f3，减压浓缩至膏状， 获得膏状物F1、膏状物F2和膏状物F3; (3)将步骤(2)中膏状物F1用少量甲醇溶解后进行MCI层析分离，分别用2个柱体积 的体积浓度10 %和体积本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种环二肽类化合物的制备方法，其特征在于所述方法是将桔青霉(Penicillium citrinum)MNP12010101接种在含钴离子的发酵培养基中，在25～30℃、200～250r/min恒温振荡条件下培养5～7d后，再在25～30℃下静置4～5d，培养液经分离纯化，获得环二肽类化合物；所述发酵培养基组成为：葡萄糖10～20g/L，蛋白胨2～5g/L，酵母浸膏1～2g/L，溶剂为体积比1:1～2的人工海水与蒸馏水混合液，pH6～7；所述每升人工海水组成为：NaCl 24.48g，Na2SO43.917g，KCl 0.664g，KBr 0.096g，SrCl20.024g，MgCl·6H2O 4.981g，CaCl2·H2O 1.102g，NaHCO30.192g，H3BO30.026g，NaF 0.004g，用蒸馏水定容至1L。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：梅建凤，金航，李靓，王鸿，应国清，易喻，陈建澍，张彦璐，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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