本发明专利技术提供了检测人二倍体细胞DNA的试剂盒及其应用。本发明专利技术通过对人细胞基因组序列比对,确定了高度保守的Alu序列,该序列在各种不同来源的人胚肺二倍体细胞中高度同源,本发明专利技术以该保守区为靶序列设计了用于检测人二倍体细胞的引物对和探针,其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1-3所示。本发明专利技术还提供了对人二倍体细胞DNA进行实时荧光定量PCR检测的方法和检测试剂盒。本发明专利技术的检测试剂盒具有检测准确,灵敏度高、特异性强,简便快速的优点,适用于目前已知的所有人胚肺二倍体细胞DNA检测,且成本低廉,既可用于临床检测也可用于生物制品生产过程的质量控制,具有良好的经济价值和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及PCR检测
,特别是涉及用于检测生物制品中人二倍体细胞DNA 的靶序列、荧光定量PCR引物和TaqMan探针,本专利技术还涉及利用该靶序列进行人二倍体细胞 检测的方法和试剂盒。
技术介绍
人二倍体细胞是最安全的细胞基质,具有很多优点:与原代细胞相比,不含有任何 外源污染因子,可以建立细胞库,能从一个冻存在安瓿瓶的细胞种子培养扩大并保持良好 的均一性。与无限传代细胞,比如vero细胞相比致瘤性以及致癌性的风险非常小。我国以及 大部分发达国家通常将人二倍体细胞作为最常用的疫苗生产细胞基质。然而随着科学技术 的提高以及人们对安全意识的提高,人二倍体细胞DNA的残留量也将会成为基于人二倍体 细胞生产的精制疫苗的主要质量控制指标之一,也将会进行严格的纯化,保证其含量在比 较低的水平。 由于精制疫苗纯化工艺能够将DNA残留量控制在比较低的水平,因此需要采用非 常敏感的技术对残留的DNA进行检测。而目前用于检测疫苗残留DNA的方法主要是分子杂交 方法,如采用随机引物方法,用地高辛、酶、生物素或放射性同位素标记并制成DNA探针,以 此探针与待测样品总DNA以及已知浓度的参比样品DNA在硝酸纤维膜上进行点杂交,最后通 过显色信号强度来判断DNA的含量。虽然这种方法比较灵敏,但是检测周期比较长,需要2-3 日,同时采用随机引物标记DNA探针的方法,稳定性和重现性较差;而且,通过杂交显色的强 度来判断DNA含量的标准不够客观。 TaqManPCR技术是近年来发展迅速的一种核酸检测技术,与传统PCR相比,在反应 体系中增加了一条两端分别标记荧光报告基团和猝灭基团的探针。探针结构完整时,荧光 报告基团发出荧光的能量转移给猝灭基团,呈现猝灭效应。如果扩增过程中有靶序列的存 在,扩增的过程中探针分子逐渐被水解切断,荧光报告基团与猝灭基团相互解离,阻断了二 者间荧光共振能量转移效应,荧光报告基团发出荧光信号。随着扩增的进行,荧光信号随着 目的片段的扩增而呈现线性增强。 与分子杂交方法相比,TaqManPCR技术应用于定量检测中具有如下优点:通过对扩 增曲线以及对数增长期的循环阈值(Ct)的分析,能对待测样品进行准确定量的分析,同时 将DNA扩增与检测过程融合为一体,可以实时、动态监测DNA扩增的全过程,省去了分子杂交 后处理过程,使得检测更加快捷方便。由于是一种封闭的检测模式,减少了气溶胶和由此造 成的假阳性。同时在PCR的基础上增加了一条可与模板互补配对的荧光探针,有效结合了 PCR和探针杂交的双重特异性,进一步提高了检测目标靶多核苷酸的特异性。因此, TaqManPCR技术在核酸检测和定量分析中,已经逐渐取代了传统的分子杂交方法,在病原体 的定量和定性检测中得到了十分广泛的应用。 美国FDA已经批准了一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒,我国也批准了乙型肝 炎、丙型肝炎、肠道病毒、HIV和SARS等,但在以二倍体为基质的疫苗中,目前还没有相应的 检测方法,更没有TaqManPCR技术快速检测残留人源DNA含量的试剂盒,满足疫苗生产和质 量控制的需要,以降低生物制品企业的生产成本,提高企业经济效益。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于检测生物制品中人二倍体细胞DNA的特异、灵敏、快 速、简便的方法以及检测试剂盒。 为实现上述目的,本专利技术通过对NCBI数据库已报道的人二倍体细胞基因序列比 对,找到Alu序列。使用NCBI在线BLAST中的conserved domains分析功能,基因组Alu序列是 哺乳动物基因组中SINE家族的一员,约有50万份拷贝。平均4~6kb中就有一个Alu序列。人 Alu序列为高度保守的序列,找到了人细胞的保守靶序列,将该序列作为检测人二倍细胞 DNA的遗传标记物。该基因组保守区的遗传标志物在各种不同来源的人胚肺二倍体细胞中 高度同源,其具有SEQ ID N0.4所示的序列或其特异性片段。本专利技术提供了该遗传标记物在 人二倍体细胞DNA检测中的应用。 专利技术人根据上述保守序列,通过反复对比,筛选,设计了用于检测该遗传标志物的 特异性引物和TaqMan探针。本专利技术引物和探针适用于目前已知的所有人胚肺二倍体细胞 DNA检测。在本专利技术的一个实施方式中,优选的特异性引物对的序列为: 上游引物序列为:5'-TGGCCAACATGGTGAAACC-3'(SEQ ID N0.1) 下游引物序列为:5'-CCACGCCCGGCTAATTTT-3'(SEQ ID N0.2) 荧光探针序列为: (FAM)5'-CGTCTCTACTAAAAATAC-3'(TAMRA)〇(SEQ ID NO.3) 本专利技术提供了上述特异性引物对和荧光探针在检测人二倍体细胞DNA中的应用。 本专利技术提供了上述特异性引物对和荧光探针在生物制品质量控制中的应用。 含有上述特异性引物对和荧光探针的试剂盒属于本专利技术的保护范围。 本专利技术提供的试剂盒,还包括荧光定量反应液,阴性模板和阳性模板,所述阴性模 板为无菌水,所述阳性模板为人二倍体细胞基因组DNA。 本专利技术的上述试剂盒基于实时荧光定量PCR方法,对待测样本提取基因组DNA后以 其为模板,利用SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0.2所示的特异性引物对和SEQ ID N0.3所示的荧光 探针进行实时荧光定量PCR,检测待测样本中的人二倍体细胞DNA。 当检测结果Ct值小于30,有明显扩增曲线,则待测样本中含有人二倍体细胞DNA, 反之为阴性。 本专利技术中用于荧光定量PCR扩增的最佳反应温度和时间为:93°C预变性2~3min; 93°C变性45s,10个循环;93°C30s,55°C45s,30个循环。TaqMan PCR反应体系中,最佳的引物 浓度为〇 · 30~0 · 34ymol/L、探针浓度为0 · 20~0 · 25ymol/L。 本专利技术提供了上述试剂盒在生物制品质量控制中的应用。本专利技术还提供了一种检测生物制品中人二倍体细胞DNA的方法,对待测生物制品 样本提取基因组DNA后以其为模板,利用SEQ ID NO. 1、SEQ ID N0.2所示的特异性引物对和 SEQ ID NO.3所示的荧光探针进行实时荧光定量PCR,检测待测生物制品样本中的人二倍体 细胞。 本专利技术中的定量参考品为人二倍细胞DNA,包括5个浓度梯度:lX104pg DNA/ml、l X103pg DNA/ml、lX102pg DNA/mlUXlObg DNA/mlUXlO^pg DNA/ml。本专利技术提供的 TaqMan PCR检测试剂盒可以检测出人二倍体细胞DNA的最低浓度为1 X H^pg NA/ml,说明 本试剂盒有非常好的灵敏度。同时本专利技术中是针对人二倍体细胞基因组DNA的基因保守区 设计特异引物和探针,可以检测出人二倍体细胞基因组DNA,但不能检测出非人二倍体细胞 基因组DNA,说明本试剂盒有良好的特异性。 基于本专利技术的技术方案,本专利技术至少取得以下优异效果: (1)特异性好。本专利技术中设计的引物和探针是针对人二倍体细胞基因组DNA的基因 保守区设计的,可特异性的检测出人二倍体细胞基因组DNA,但不能检测出非人二倍体细胞 基因组DNA。 (2)灵敏度高。本专利技术提供的实时荧光定量PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测人二倍体细胞DNA的遗传标记物,其具有SEQ ID NO.4所示的序列或其特异性片段。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:金亚明,吕哲,王奚瑶,王琳,张星星,高强,尹卫东,
申请(专利权)人:北京科兴中维生物技术有限公司,
类型:发明
国别省市:北京;11
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