【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及干细胞工程、组织工程与生物起搏等领域,特别是涉及干细胞培养与鉴定
技术背景极小胚胎样干细胞(verysmallembryonic-likestemcells,VSELs)于2006年由美国肯塔基州路易斯维尔大学M.Ratajczak教授等从小鼠骨髓单个核细胞中成功分离并命名,细胞表型为Sca-1(+)lin(-)CD45(-),直径2-4μm。该团队进一步研究发现人骨髓、脐带血、外周血、脑、心肌、肾脏、胰腺等组织中同样存在,细胞表型为SSEA-4+/Oct-4+/CD133+/CXCR4+/Lin-/CD45-,直径为4-6μm。人和鼠VSELs的生物学特性主要包括:较血小板大,红细胞小,细胞核大,含常染色质,表达原始多能干细胞标志Oct-4和Nanog,可以向三个胚层分化,且无免疫排异与伦理问题,被认为具有替代胚胎干细胞的潜力。由于VSELs在一般体外培养条件下极易分化且体外很难扩增,甚至引起一些学者的质疑。加州斯坦福大学Weissman按照Ratajczak团队最初所描述的方法重复实验并广泛分析,尽管在他的实验中发现这些小细胞,但其并没有像多能干细胞那样,在体外聚集成球,也无法扩增。M.Ratajczak团队研究结果也表明人或鼠的VSELs数量均极少(只占骨髓单个核细胞的0.01%-0.04%),故即使存在VSELs,其极低的数量级也成为VSELs进入临床的瓶颈。因此,如何改进培养和鉴定技术是VSE ...
【技术保护点】
一种猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法,其特征在于,将分离、纯化后得到的猪骨髓极小胚胎样干细胞接种于铺有成肌细胞饲养层的培养板中,用RPMI 1640培养基进行培养,置于37℃、5% CO2的培养箱中,并添加双抗(青‑链霉素储存液)、白血病抑制因子(LIF)、碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)等细胞因子进行培养,每2天更换1次培养液,培养9至11天可以进行传代。
【技术特征摘要】
1.一种猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法,其特征在于,将分离、纯化后得到的猪骨
髓极小胚胎样干细胞接种于铺有成肌细胞饲养层的培养板中,用RPMI1640培养基进行培
养,置于37℃、5%CO2的培养箱中,并添加双抗(青-链霉素储存液)、白血病抑制因子(LIF)、
碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、干细胞因子(SCF)等细胞因子进行培养,每2天更换1次培
养液,培养9至11天可以进行传代。
2.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法,其特征在于,所述的
双抗(青-链霉素):取青、链霉素各100万单位溶于100mLPBS缓冲液中。
3.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法,其特征在于,所述的
成肌细胞饲养层,其制备包括如下步骤:
一是乳猪成肌细胞分离,步骤包括:
(1)将乳猪麻醉后,无菌条件下分离新生乳猪的骨骼肌样本,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)
清洗,并尽量剔除表面结缔组织;
(2)将骨骼肌组织样本置于离心管中,剪成1mm3的块状,加入1g/L的胶原蛋白酶Ⅱ,置
于37℃恒温水浴中消化,20~40分钟后,1200rpm离心6分钟,弃上清;
(3)加入0.25%胰酶消化液,轻微吹打3~5分钟,可见消化液变浑,此时取上清液于
另一干净的试管中,加入等体积含有10~15%胎牛血清的DMEM终止消化,剩余组织可重复消
化1次;
(4)轻轻吹打细胞悬液,吹散细胞,用400目过滤筛过滤,1200rpm离心6分钟,弃
去上清液,用新鲜DMEM液洗2~3次,1200rpm离心6分钟;
(5)用10~15%胎牛血清+10%马血清的F12培养基重悬细胞,接种于培养皿中,至于培
养箱中培养;
(6)培养1.5~2小时后,将上清液移于另一培养皿中继续培养,以去除非肌原性细胞;
(7)培养5~6天,细胞生长至80%贴壁,可以进行传代;
(8)弃去培养基,用PBS清洗细胞3次,加入适量0.25%胰酶消化3~5分钟,用含有10%
胎牛血清的培养基终止消化,1200rpm离心6分钟,用培养基重悬细胞,接种于培养皿中,
置于37℃,5%CO2培养箱中继续培养;40分钟后,将含细胞的上清液移于另一培养皿中
继续培养;
二是乳猪成肌细胞饲养层制备,步骤包括:
(1)将传至3代细胞的培养基吸出,加入适量丝裂霉素C溶液,置于培养箱中培养1~2
小时后,弃去丝裂霉素C溶液,用PBS清洗7~8次,加入适量0.25%胰酶消化3~5分钟,用含
有10%胎牛血清的培养基终止消化,1200rpm离心6分钟,用培养基重悬清洗细胞2次,
1200rpm离心6分钟,培养基重悬细胞,接种于96孔板中,置于培养箱中培养;
(2)观察到细胞融合至60%左右,即获得成肌细胞饲养层。
4.根据权利要求3所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法,其特征在于,所述的
乳猪为出生2-4天的乳猪。
5.如权利要求3所述的所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法,其特征在于,所
述的0.25%胰蛋白酶,是将0.25g胰蛋白酶溶于100mLPBS缓冲液中,调整PH值至7.2,使用
0.22um微孔滤膜过滤除菌,分装后置于-20℃环境中备用。
6.根据权利要求3所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法,其特征在于,所述的
PBS缓冲液(不含Ca、Mg):取Na2HPO4·12H2O1.4425g,KH2PO40.1g,NaCl4g,KCl0.1g,溶
解于500mL新制备的超纯水中,定容后调整PH至7.2,高压灭菌后,4℃环境中保存。
7.根据权利要求1所述的猪极小胚胎样干细胞的体外培养方法的鉴定方法,其特征在
于,用透射电镜鉴定所述的猪VSELs,步骤包括:将分离或培养后的CD45(-)CD133(+)
lin(-)的单核细胞收集、固化、包埋进行透视电镜观察细胞形态和超微结构...
【专利技术属性】
技术研发人员:顾翔,李碧春,顾健,孙加斌,金凯,蒋一秀,罗雪,朱业,孙磊,胡茂志,石青青,朱睿,王竟悟,顾艺荀,苗书航,
申请(专利权)人:江苏省苏北人民医院,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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