用于差分检测的嵌入染料制造技术

提供了用于检测和定量核酸序列的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请的交叉参考本申请要求于2014年1月10日提交的美国临时申请61/926,172号的优先权，该文的全部内容通过引用纳入本文用于所有目的。
技术介绍
可检测或定量核酸以搜索有用的基因、诊断疾病或鉴定生物体。设计为检测或定量核酸的分子方法可用于检测突变、检测稀有核酸、定量基因表达、测量RNA稳定性等。这类分子方法可用于确定核酸的相对比例。例如，分子方法可用于确定与样品中野生型核酸的丰度相比突变或多态性核酸的丰度。用于检测或定量核酸的方法和组合物包括数字方法，其中样品被分为多个混合物划分产物并确定各划分产物中是否存在一种或多种感兴趣的核酸。在一些情况中，两种或多种检测试剂或探针被用于检测划分产物中两种或多种感兴趣的核酸。在这类情况中，探针或其他检测试剂的交叉反应性可使得难以明确地检测或定量感兴趣的核酸。例如，当一种感兴趣的核酸比另一种更普遍时，例如当一种核酸代表野生型序列且另一种代表突变时，检测试剂的交叉反应性可造成特别的困难。当一种感兴趣的核酸与另一种非常类似时，交叉反应性也可造成特别的困难。
技术实现思路
在一些实施方式中，本专利技术提供一种核酸序列检测方法，包括：提供包含DNA或RNA核酸的样品；将所述样品划分为一组混合物划分产物；使用序列特异性检测试剂检测划分产物中是否存在靶核酸；以及使用非特异性检测试剂检测划分产物中是否存在双链核酸，从而检测划分产物中靶核酸与总核酸的比率。在一些方面中，在检测前扩增核酸。在一些情况中，该非特异性检测试剂是标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸。例如，该非特异性检测试剂是在扩增步骤期间掺入至一个或多个结构上不同的扩增子中的标记的核苷三磷酸，且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸，并检测一个或多个结构上不同的扩增子中掺入的标记物。在一些方面中，该非特异性检测试剂是嵌入染料。例如，该嵌入染料可选自：EvaGreen、picogreen、溴化乙啶、SYBRGreenI、SYBRGold、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO和BEBO。在一些方面中，该序列特异性检测试剂选自结构化探针(structuredprobe)和线性探针。在一些情况中，该结构化探针选自分子信标和蝎型探针(scorpionprobe)。在一些情况中，该线性探针选自杂交探针和水解探针。在一些方面中，该非特异性检测试剂是检测总双链核酸的引物(或引物的混合物，如随机引物的混合物)。在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该核酸是RNA，且该方法还包括逆转录该RNA核酸。在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该方法包括扩增两种或多种潜在的扩增子。在一些方面中，在存在双链核酸的混合物划分产物中，潜在的扩增子之一的量为小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少。在一些情况中，该序列特异性检测试剂检测一种特异性扩增子，且该非序列特异性检测试剂检测任何扩增子。在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该序列特异性检测试剂检测序列变体。在一些情况中，该序列变体是稀有序列变体。在一些情况中，双链核酸存在于多个混合物划分产物中，且该稀有序列变体存在于小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少的混合物划分产物中。在前述实施方式、方面或情况的任一种的一个方面中，该方法包括通过对混合物划分产物数目进行计数来确定总核酸浓度，所述混合物划分产物中非特异性检测试剂检测到核酸或检测到扩增的核酸。在一些情况中，该方法还包括通过对混合物划分产物数目进行计数来确定靶核酸序列浓度，所述混合物划分产物中序列特异性检测试剂检测到核酸或检测到扩增的核酸。在一些情况中，该方法还包括确定其中序列特异性检测试剂检测到核酸(如扩增的核酸)的混合物划分产物与其中非序列特异性检测试剂检测到核酸(如扩增的核酸)的混合物划分产物的比率，该比率表示样品中包含靶核酸的核酸比例。在一些情况中，该方法还包括报告该比率。在一个实施方式中，本专利技术提供一种核酸序列检测方法，包括：提供包含DNA或RNA核酸的样品，该DNA或RNA核酸包含第一靶标和第二靶标；将所述样品划分为一组混合物划分产物；以及使用结合第一靶标(如果存在)的特异性检测试剂(如特异性检测第一靶标而非第二靶标)和结合并从而检测两种靶标(如果存在)的非特异性检测试剂来检测至少一个混合物划分产物中的第一靶标和第二靶标；从而确定样品中第一靶标的浓度以及第一和第二靶标的浓度。在一个方面中，该方法还包括在混合物划分产物中扩增这些靶标；检测包括检测第一和第二靶标的扩增；且该特异性检测试剂结合代表第一靶标的扩增子(例如特异性结合并从而检测第一靶标而非第二靶标的扩增子)且该非特异性检测试剂结合并从而检测代表第一和/或第二靶标的扩增子。在一个方面中，该检测包括在至少一个混合物划分产物中确定是否存在第一靶标且确定是否存在第一或第二靶标。在一些情况中，对多种混合物划分产物进行检测。在一些情况中，该方法还包括确定包含第一靶标的混合物划分产物与包含第一或第二靶标的混合物划分产物的比率。在一些情况中，该方法还包括报告该比率。在一个方面中，该第一靶标是突变体或多态性且该第二靶标是野生型核苷酸序列。在一个实施方式中，本专利技术提供了一种包含少于约100nL的混合物划分产物的组合物，其包含：包含DNA或RNA的核酸；非特异性检测试剂；和序列特异性检测试剂。在一个方面中，该组合物还包含扩增试剂。在一个方面中，该非特异性检测试剂选自：EvaGreen、溴化乙啶、SYBRGreenI、SYBRGold、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO和BEBO。该非特异性检测试剂可以是检测总双链核酸的引物。该非特异性检测试剂可以是标记的核苷三磷酸。该序列特异性检测试剂可选自分子信标、蝎型探针、杂交探针和水解探针。在一个实施方式中，本专利技术提供了一组混合物划分产物，其中，多个混合物划分产物包含前述组合物之一。在一些情况中，该组包含至少约100、200、500或1000个混合物划分产物。在一些情况中，多个混合物划分产物包含双链核酸。在一些情况中，大多数包含双链核酸的混合物划分产物不包含靶核酸。在一些情况中，该靶核酸是序列变体。附图简要说明图1：描述了通过使用两种序列特异性探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种核酸序列检测方法，所述方法包括：提供包含DNA或RNA核酸的样品；将所述样品划分为一组混合物划分产物；使用序列特异性检测试剂检测所述划分产物中是否存在靶核酸；以及使用非特异性检测试剂检测所述划分产物中是否存在双链核酸，由此检测所述划分产物中靶核酸与总核酸的比率。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.01.10 US 61/926,1721.一种核酸序列检测方法，所述方法包括：
提供包含DNA或RNA核酸的样品；
将所述样品划分为一组混合物划分产物；
使用序列特异性检测试剂检测所述划分产物中是否存在靶核酸；以及
使用非特异性检测试剂检测所述划分产物中是否存在双链核酸，
由此检测所述划分产物中靶核酸与总核酸的比率。
2.如权利要求1所述的方法，其中，在检测前扩增所述核酸。
3.如权利要求2所述的方法，所述非特异性检测试剂是标记的核苷三磷酸，
且检测是否存在双链核酸的步骤包括在扩增后洗去未掺入的标记的核苷三磷酸。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述非特异性检测试剂是嵌入染料。
5.如权利要求4所述的方法，所述嵌入染料选自：EvaGreen、picogreen、溴
化乙锭、SYBRGreenI、SYBRGold、Yo-Yo、Yo-Pro、TOTO、BOXTO和BEBO。
6.如权利要求1、2、4或5中任一项所述的方法，所述非特异性检测试剂是
检测总双链核酸的引物。
7.如权利要求1-5中任一项所述的方法，所述序列特异性检测试剂选自结构
化探针和线性探针。
8.如权利要求7所述的方法，所述结构化探针选自分子信标和蝎型探针。
9.如权利要求7所述的方法，所述线性探针选自杂交探针和水解探针。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述核酸是RNA，且所述方法还
包括逆转录所述RNA核酸。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括扩增两种或更多种潜
在扩增子。
12.如权利要求11所述的方法，其中，存在有双链核酸的混合物划分产物中，
所述潜在扩增子之一的量为小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、0.5％、
0.1％、0.05％、0.01％或更少。
13.如权利要求11所述的方法，所述序列特异性检测试剂检测一种特异性扩
增子，且所述非序列特异性检测试剂检测任意扩增子。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述序列特异性检测试剂检测序列
变体。
15.如权利要求14所述的方法，所述序列变体是稀有序列变体。
16.如权利要求15所述的方法，其中，双链核酸存在于多个混合物划分产物
中，且所述稀有序列变体存在于小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％、
0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或更少的混合物划分产物中。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括通过计数其中非特
异性检测试剂检测到核酸的混合物划分产物的数目来确定总核酸浓度。
18.如权利要求17所述的方法，所述方法还包括通过计数其中序列特异性检
测试剂检测到核酸的混合物划分产物的数目来确定靶核酸序列浓度。
19.如权利要求18所述的方法，所述方法还包括确定其中序列特异性检测试
剂检测到核酸的混合物划分...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·蒂佐内弗，
申请(专利权)人：生物辐射实验室股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US