一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用制造技术

一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及其应用，属于生物工程技术领域。该工程菌的保藏编号为CGMCC No.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年9月29日。本发明专利技术主要公开嗜热碱性果胶裂解酶，最适反应温度为70℃，最适Ca2+浓度为0.8mM，底物为0.2％(w/v)多聚半乳糖醛酸，pH9.5。该酶在最适pH9.5、Ca2+0.8mM、70℃时酶比活为900U/mg；在70℃保温下，半衰期为6h；经过镍柱纯化处理后CbPelC可达到50mg/L(1L发酵液)。本发明专利技术所述嗜热碱性果胶裂解酶的耐热性和产量有大幅度挺高，更加适应现代工业生产要求，也为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种嗜热碱性果胶裂解酶基因、工程菌、嗜热碱性果胶裂解酶及该酶在降解果胶物质中的应用。
技术介绍
果胶物质主要由多聚半乳糖醛酸(GalA)组成，并且侧链还常带有海藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖等，广泛存在于植物初生细胞壁中。果胶酶是一系列分解果胶物质的酶类的总称，在高等植物和微生物中分布甚广。植物在成熟过程中，果胶酶使植物细胞壁更松软，对植物组织腐败再生平衡也起到了重要作用。果胶酶按其作用方式的不同可分为两大类，即酯酶和解聚酶，而解聚酶又分为水解酶和裂解酶。水解酶是通过引入水分子水解糖苷键，而裂解酶是通过反式消去作用断裂糖苷键。果胶裂解酶是果胶酶的重要组成部分，是一种能降解植物细胞壁并导致植物组织软化甚至死亡的解聚酶，它在果胶降解过程中起着重要的作用。其作用机制是通过β-消旋的方式作用于断裂糖苷键，形成不饱和双键，产生不饱和的半乳糖醛酸寡聚糖。果胶裂解酶也是麻料脱胶工艺和纺织工艺中不可缺少的主要酶类。在医药、生物技术、饲料加工、环保方面也具有相当地位，在木材防腐和造纸等方面也应用广泛。目前果胶裂解酶主要以碱性酶为主，而且大多是常温酶，嗜热酶较少，迄今为止，关于嗜热纤维素酶的报道很多，而关于嗜热果胶酶的报道很少。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种Caldicellulosiruptorbescii基因来源的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌以及构建方法，所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌EscherichiacoliBL21(DE3)/pET20b(+)-PelC，其保藏编号为CGMCCNo.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，保藏日期为2015年9月29日。工程菌表达产物是细胞可溶性蛋白，通过细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，进行分离纯化得到嗜热蛋白，即嗜热碱性果胶裂解酶。本专利技术制备的嗜热碱性果胶裂解酶的产量可达到50mg/L(1L发酵液)，相对现有国内筛选到的碱性果胶酶，是一种效价很高的碱性果胶酶，为进一步实现工业化铺垫，也为工业大规模生产碱性果胶酶提供了有效地方法。本专利技术所述的嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌以源于热梭杆菌CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725的基因为模板，设计引物，通过PCR反应扩增3’端含有6个组氨酸标签的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，测序谱图如图1所示。将该嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC连接到表达载体pET20b(+)上获得重组表达载体，将该重组表达载体转化到大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中得到嗜热碱性果胶裂解酶工程菌。本专利技术所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌的构建方法参见文献：OverproductionofalkalinepolygalacturonatelyaseinrecombinantEscherichiacolibyatwo-stageglycerolfeedingapproach.2011，ShuyingFang，JianghuaLi，LongLiu，GuochengDu，JianChen.Volume102，Issue22，November2011，Pages10671–10678。具体步骤如下：(1)以热梭杆菌CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725全基因组DNA为模板，设计引物，通过PCR反应扩增得到3’端含有6个组氨酸标签基因的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因；(2)将步骤(1)得到的嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC酶切后与pET20b(+)表达载体连接，得到重组表达载体pET20b(+)-PelC；(3)将重组表达载体pET20b(+)-pelC转化到大肠杆菌表达宿主EscherichiacoliBL21(DE3)中，构建得到本专利技术所述的嗜热碱性果胶裂解酶工程菌EscherichiacoliBL21(DE3)/pET20b(+)-PelC。PCR引物，包括上游引物和下游引物，上游引物：5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC3'，下游引物：5'CCGCTCGAGTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGGTATTGATG3'，上游引物5'端CATATG为NdeⅠ酶切位点，保护碱基GGAATTC；下游引物5'端CTCGAG为XholⅠ酶切位点，保护碱基CCG。所述的重组表达载体pET20b(+)-PelC是将嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC插入到表达载体pET20b(+)的NdeⅠ和XholⅠ位点间得到。所述工程菌是将重组表达载体导入感受态细胞E.coliBL21(DE3)得到的。本专利技术的第二个目的是提供一种应用本专利技术所述的工程菌发酵生产的嗜热碱性果胶裂解酶，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。其是将嗜热碱性果胶裂解酶工程菌接种(接种量2‰～5‰(v/v))至装有20mL种子培养基的50mL锥形瓶中，37℃、170r/min振荡培养至OD600＝6.0，获得种子液；然后将种子液接种至含有50μg/mL氨苄的发酵培养基中，接菌量为2‰～5‰(v/v)，装液量为2L/5L(2L指的是发酵培养液体积，5L指的是锥形瓶的容积)，于37℃、170r/min振荡培养至OD600＝0.6时加入终浓度0.5mMIPTG进行诱导，同时将温度调整为25～28℃，转速调整为100～120r/min，诱导发酵18～24h，从而得到工程菌发酵液。将细胞超声破碎，加热失活大肠杆菌杂蛋白，通过镍柱亲和层析法得到嗜热碱性果胶裂解酶。经过镍柱纯化处理后嗜热碱性果胶裂解酶含量可达到50mg/L(1L发酵液)。在上述方法中，所述种子培养基的溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；培养基的pH值为7.0-7.2；发酵培养基的成份如下：培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度为：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L；培养基的pH值为7.0～7.2；本专利技术的第三个目的是提供所述的嗜热碱性果胶裂解酶在降解果胶物质中的应用。在本专利技术应用中，所述果胶物质为多聚半乳糖醛酸。本专利技术所述嗜热碱性果胶裂解酶，在70℃降解多聚半乳糖醛酸的酶活为900U/mg；热...

【技术保护点】
一种嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌，其特征在于：该工程菌的保藏编号为CGMCC
No.11460，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichiacoli，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理
委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年9月29日。
3.权利要求2所述的一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌的构建方法，其步骤如下：
(1)以CaldicellulosiruptorbesciiDSM6725全基因组DNA为模板，设计引物，通过
PCR反应扩增得到3’端含有6个组氨酸标签基因的嗜热碱性果胶裂解酶PelC基因；
(2)将步骤(1)得到的嗜热碱性果胶裂解酶基因PelC酶切后与pET20b(+)表达载体
连接，得到重组表达载体pET20b(+)-PelC；
(3)将重组表达载体pET20b(+)-pelC转化到大肠杆菌表达宿主Escherichiacoli
BL21(DE3)中，构建得到嗜热碱性果胶裂解酶工程菌。
4.如权利要求3所述的一种嗜热碱性果胶裂解酶基因工程菌的构建方法，其特征在于：PCR
引物包括上游引物和下游引物，
上游引物5'GGAATTCCATATGATTGGGTTGCGTAATGAAGTTGCAAAGGCAGC3'，
下游...

【专利技术属性】
技术研发人员：张作明，李海超，张静，李正强，于擎，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22