使用多个温度区域的核酸扩增制造技术

本发明专利技术涉及采用具有不同温度区域的方法和装置对经扩增的核酸序列进行扩增和检测。本发明专利技术的方法和装置可以用于定量分析目标核酸序列、用于同时定量分析多个目标核酸序列或用于分析样品以确定目标核酸的存在。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于进行核酸序列扩增的过程并涉及一种用于实施本专利技术的方法的装置。本专利技术尤其适于对样品（例如生物样品）中存在的核酸进行同时识别和定量。此外，本专利技术涉及一种在包括彼此热去耦的至少两种区域的反应容器中的扩增溶液中，对扩增反应中特别是聚合酶链式反应（PCR）中的目标核酸序列进行扩增和定量实时检测的装置，其中一个区域为具有允许寡核苷酸探针杂交到核酸序列的基本恒定生成温度的表面杂交区域，其中表面杂交区域的内表面包括用于目标核酸序列的捕获探针。
技术介绍
可以使用各种扩增反应来执行核酸序列的扩增，其中且最突出的是聚合酶链式反应（PCR）。PCR是一种用于扩增特定核酸序列的方法。PCR为主要在溶液中进行的酶反应。当扩增过程被实时监测时，PCR可以用于定量分析。实时PCR通常使用荧光报告分子，诸如插入染料、TaqMan探针、蝎形引物、分子信标。当需要分析多于一种核酸目标序列时，可以采用两种方法。第一种方法是使反应平行进行，即，在分离隔室中运行每种反应。第二种方法是对反应进行复用，即，在同一隔室中运行反应并针对每种反应使用不同的荧光团报告分子。这种方法受可以被有效区分的荧光团的数目限制。当前的技术发展水平是可以复用六种反应。附图1说明当前的单室多重PCR以及阵列PCR构思。PCR过程和表面杂交过程的热要求大不相同。PCR扩增过程要求（快速）温度循环，其中在循环的一部分中，样品是在dsDNA熔化温度之上。另一方面，表面杂交需要在低于核酸熔点的温度进行，且为了得到最优性能，应避免捕获探针部位之上的扩增子的漫射限制局部耗尽。本专利技术的多个区域构思允许对这两种过程即扩增和表面杂交的去耦优化。
技术实现思路
本专利技术涉及一种使用不同温度区域扩增和检测目标核酸序列的方法和装置。特别是，本专利技术涉及用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液（其有可能包括具有目标核酸序列的核酸）中的目标核酸序列的方法，包括下述步骤：（a）提供反应容器，该反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补；（b）向所述反应容器添加扩增溶液；（c）生成具有至少两种热去耦区域的反应容器中的温度区域分布图，其中一种区域与表面杂交区域相同或至少交叠，其中表面杂交区域具有允许捕获探针杂交到目标核酸序列的生成温度；（d）在反应容器中执行目标核酸序列的扩增；以及（e）在扩增期间和/或之后定期地或以限定的时间间隔检测经扩增的核酸序列，其中经扩增的核酸序列通过在所述表面杂交区域中捕获探针与所述经扩增的核酸序列的杂交而检测。在该方法的特别优选实施例中，或者是（a）每个表面杂交区域用于仅在整个扩增过程的特定阶段杂交和检测经扩增的目标核酸序列，或者是（b）至少一个表面杂交区域用于在整个扩增过程的多个阶段杂交和检测经扩增的目标核酸序列。优选地，扩增在聚合酶链式反应（PCR）中执行并且扩增溶液包括核酸聚合酶以及与所述目标核酸基本互补的引物。本专利技术还涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的装置，包括：（a）反应容器，其包括彼此热去耦的至少两种区域，其中一种区域为具有允许捕获探针杂交到互补目标核酸序列的基本恒定生成温度的表面杂交区域，其中表面杂交区域的内表面涂布有用于目标核酸序列的捕获探针，（b）检测系统，其检测结合到所述捕获探针的目标，（c）一个或多个温度控制器和一个或多个温度调节器，用于控制、调节和维持各区域中的温度，以及（d）传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液。优选地，检测系统基本不检测未结合到所述捕获探针的目标。本专利技术还涉及一种用于扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的试剂盒（cartridge），包括：用于接收包含所述目标核酸序列的扩增溶液的反应容器，其中反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补。优选地，反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少两个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补。在试剂盒作为本专利技术装置的部件的上下文中，已经在上文中讨论了试剂盒的一些说明性实施例的特征。这种试剂盒的具体实施例在附图14中说明。当插入该装置时，试剂盒中的表面杂交区域优选地与该装置中生成允许杂交的温度的那个区域交叠。因而，本专利技术还涉及一种用于接收本专利技术的试剂盒的装置，其中该装置包括：一个或多个温度控制器和/或温度调节器用于生成所述试剂盒中包括的反应容器中的至少两种温度区域的温度分布图，其中一种区域具有允许捕获探针杂交到互补目标核酸序列的基本恒定生成温度且其中温度控制器和/或温度调节器控制、调节和维持各区域中的温度；检测系统，该检测系统检测结合到所述捕获探针的目标，但是基本不检测未结合到所述捕获探针的目标；传输系统，用于在各区域之间传输扩增溶液；以及用于所述试剂盒的接收元件。优选的是，当试剂盒插入该装置时，试剂盒的表面杂交区域与该装置中生成允许杂交的温度的那个区域交叠。优选的是，反应容器包括在可交换试剂盒中。将本专利技术的方法、试剂盒和装置用于定量分析目标核酸序列，用于同时定量分析多个目标核酸序列，或者用于分析样品以确定目标核酸的存在，这些也在本专利技术的范围之内。优选地，此处描述的方法和装置用于临床诊断、定点照护诊断、生物分子诊断、基因或蛋白质表达阵列、环境传感器、食品质量传感器或法医应用。本专利技术还涉及本专利技术的方法、试剂盒和装置在实时PCR或实时多重PCR中的用途。附图说明图1：说明在实时阵列PCR期间的步骤，该实时阵列PCR与实时PCR相似，每个循环包括3个温度步骤。图1的说明性实例中说明的实时阵列PCR与一般的实时PCR之间的差别在于，在实时阵列PCR中，退火步骤与杂交步骤组合。图2：说明唯一样品体积中具有热隔离区域的区域构思。图3：具有分离室的区域构思的可能实施例。理想地但不限于，表面杂交区域的温度接近PCR循环的退火温度的温度。图4：具有分离室的区域构思的可能实施例，其中样品可以在室周围传输。理想地但不限于，表面杂交区域的温度接近PCR循环的退火温度的温度。图5：具有三个恒定温度区域的可能实施例，样品在该三个恒定温度区域之间循环。图6：具有两个恒定温度区域的可能实施例，样品在该两个恒定温度区域之间循环。短长度的扩增子的优选实施例。图7：两个恒定温度区域，样品在其周围循环。一个区域呈通道的形式，该通道具有用于表面杂交的捕获探针部位。图8：PCR产物本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于非疾病诊断的扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的方法，包括下述步骤：提供反应容器，该反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补；向所述反应容器添加扩增溶液；生成具有至少两种热去耦区域的反应容器中的温度区域分布图，其中一种区域与表面杂交区域相同或至少交叠，其中表面杂交区域具有允许捕获探针杂交到目标核酸序列的生成温度；在反应容器中执行目标核酸序列的扩增；在扩增期间和/或之后定期地或以限定的时间间隔检测经扩增的核酸序列，其中经扩增的核酸序列通过在所述表面杂交区域中捕获探针与所述经扩增的核酸序列的杂交而检测，在整个扩增过程的多个阶段使用多个表面杂交区域用于杂交和检测，提供所述至少两个热去耦区域中的两个或更多个，使得它们包括在反应容器的同一隔室或体积中或者包括在反应容器的分离隔室或体积中，其中提供反应容器，使得所述反应容器包括具有基本恒定生成温度的多个表面杂交区域且具有在扩增溶液的熔点到沸点范围内的可变温度的至少一个温度循环器区域，其中扩增溶液从温度循环器区域传递到表面杂交区域以用于检测经扩增的目标核酸，并且反过来用于进一步的扩增。...

【技术特征摘要】
2008.06.24 EP 08158774.31.用于非疾病诊断的扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的方法，包
括下述步骤：
提供反应容器，该反应容器包括在表面上固定捕获探针的至少一个表面杂交区域，其
中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补；
向所述反应容器添加扩增溶液；
生成具有至少两种热去耦区域的反应容器中的温度区域分布图，其中一种区域与表面
杂交区域相同或至少交叠，其中表面杂交区域具有允许捕获探针杂交到目标核酸序列的生
成温度；
在反应容器中执行目标核酸序列的扩增；
在扩增期间和/或之后定期地或以限定的时间间隔检测经扩增的核酸序列，其中经扩
增的核酸序列通过在所述表面杂交区域中捕获探针与所述经扩增的核酸序列的杂交而检
测，
在整个扩增过程的多个阶段使用多个表面杂交区域用于杂交和检测，
提供所述至少两个热去耦区域中的两个或更多个，使得它们包括在反应容器的同一隔
室或体积中或者包括在反应容器的分离隔室或体积中，
其中提供反应容器，使得所述反应容器包括具有基本恒定生成温度的多个表面杂交区
域且具有在扩增溶液的熔点到沸点范围内的可变温度的至少一个温度循环器区域，其中扩
增溶液从温度循环器区域传递到表面杂交区域以用于检测经扩增的目标核酸，并且反过来
用于进一步的扩增。
2.根据权利要求1的方法，其中反应容器包括至少一个温度循环器区域和多个表面杂
交区域，其中扩增反应为聚合酶链式反应（PCR）且其中聚合酶链式反应的至少变性和引物
延伸在温度循环器区域中执行且温度循环器区域中的温度至少在变性温度和延伸温度之
间循环。
3.根据权利要求2的方法，其中在温度循环器区域中执行对所述目标核酸的引物退火
且其中温度循环器区域中的温度在变性温度、退火温度和延伸温度之间循环。
4.根据权利要求1或2的方法，其中多个表面杂交区域中的温度适合于对所述目标核酸
的引物退火且其中在表面杂交区域中执行对所述目标核酸的引物退火。
5.用于非疾病诊断的扩增和检测反应容器中的扩增溶液中的目标核酸序列的装置，包
括：
反应容器，用于接收包括所述目标核酸序列的扩增溶液，其中反应容器包括用于杂交
和检测经扩增的目标核酸序列的多个表面杂交区域，在该表面杂交区域中在表面上固定捕
获探针，其中所述捕获探针与所述目标核酸序列上的区域基本互补，以及包括至少一个其
它类型的区域；
一个或多个温度控制器，用于控制所述反应容器中至少两种温度区域的温度分布图，
其中一种区域与所述表面杂交区域基本交叠，且其中多个表面杂交区域具有在整个扩增过
程的一个以上的阶段允许捕获探针杂交到互补目标核酸序列的基本恒定生成温度；
检测系统，该检测系统检测结合到所述捕获探针的目标核酸序列但是基本不检测未结
合到所述捕获探针的目标核...

【专利技术属性】
技术研发人员：DJW克伦德，A皮里克，A克莱斯尼申科，MI博亚姆法，RJM施罗德斯，
申请(专利权)人：皇家飞利浦电子股份有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL